蟾毒灵诱导人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU凋亡的作用及机制研究

摘要

[背景] 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)内在的多药耐药性以及化疗过程中产牛的获得性多药耐药性是HCC化疗失败的主要原因之一。迄今为止仍没有发现用于肝癌化学治疗的有效药物,开发新的化学治疗药物仍然是中晚期肝癌内科治疗领域的热点。蟾酥为我国传统的抗肝癌中药材,以蟾酥为主治疗肝癌具有非常悠久的历史。本课题组前期的研究发现,蟾酥的有效活性成分——蟾毒灵具有很强的抗肝癌作用,有可能成为克服肝癌多药耐药,治疗中晚期肝癌的有效药物。研究发现蟾毒灵具有抑制耐药细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用,但是其具体机制如何,在体内是否具有相同的作用还值得进一步研究。因此,本课题以人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU为研究对象,在初步证实蟾毒灵能够抑制肝癌多药耐药细胞增殖的基础上,对其诱导凋亡的作用及机制进行了深入探讨,并对其体内抑制肝癌的作用进行了初步观察。 [目的] 研究蟾毒灵诱导人肝癌多药耐药BEL-7402/5-FU细胞凋亡的作用,并探讨其可能机制。建立人肝癌5-氟尿嘧啶获得性多药耐药裸鼠原位移植瘤模型,评价蟾毒灵对肝癌多药耐药模型的抗肿瘤作用。 [方法] 1、蟾毒灵对人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU增殖的影响 MTT法观察蟾毒灵、5-氟尿嘧啶、长春新碱、阿霉素、奥沙利铂、环磷酰胺对人肝癌BEL-7402/5-FU获得性多药耐药细胞株增殖抑制作用。蟾毒灵对亲本及耐药细胞增殖抑制作用的时效、量效关系。 2、蟾毒灵诱导耐药细胞株凋亡的作用 光镜观察不同浓度(1、0.1、0.01 μM)蟾毒灵作用于人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU 24 h后细胞形态学改变。激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度蟾毒灵(1、0.1、0.01 μM)作用24 h后细胞凋亡的特征性荧光分布变化。流式细胞术检测不同浓度蟾毒灵(1、0.1、0.01 μM)作用24 h对人肝癌BEL-7402/5-FU细胞株细胞周期及细胞凋亡的作用。 3、蟾毒灵诱导耐药细胞凋亡的机制研究 免疫细胞化学和Western blot法检测蟾毒灵对人肝癌BEL-7402/5-FU细胞Bcl-XL及Bax蛋白表达的影响。流式细胞术检测蟾毒灵作用后,人肝癌BEL-7402/5-FU细胞株线粒体膜电位的变化与时效关系,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的改变及蟾毒灵对Caspase-9作用的时效-量效关系,并观察Caspase-9特异性抑制剂对蟾毒灵诱导细胞凋亡的影响。 4、蟾毒灵对裸鼠人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU原位移植瘤模型的作用 采用“隧道内植入法”建立人肝癌5-氟尿嘧啶获得性多药耐药裸鼠原位移植瘤模型。移植12d后,挑选肿瘤大小相近的裸鼠,随机分为生理盐水组,氟尿嘧啶组(20 mg/kg·d),蟾毒灵组(1 mg/kg·d)及蟾毒灵(1 mg/kg·d)与5-氟尿嘧啶(20 mg/kg·d)联合用药组(交替给药),给药14 d。治疗结束后采血行肝肾功能及生化检查；游标卡尺测量肿瘤最大径和最小径,计算肿瘤体积；免疫组化法检测生理盐水组TS蛋白表达；HE染色行心、肝、肾组织病理学检查,同时观察肝癌组织病理学改变；TUNEL法检测各组肿瘤组织凋亡率。 [结果] 1、人肝癌BEL-7402/5-FU细胞株对临床常用化疗药5-氟尿嘧啶、长春新碱、阿霉素、奥沙利铂、环磷酰胺的耐药指数分别为：18.6±2.85、10.22±2.85、2.12±0.20、5.91±1.08、8.92±2.46,但对蟾毒灵无明显交叉耐药性,蟾毒灵对人肝癌BEL-7402/5-FU细胞株的增殖抑制作用呈明显的浓度依赖性。 2、蟾毒灵处理细胞24 h后可见部分细胞变圆、脱落悬浮于培养液中,细胞体积大小不一,肿胀、固缩的细胞均可见到,细胞内颗粒增多、光密度增强。 3、经1、0.1、0.01μM蟾毒灵处理人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞后, G0/G1期细胞分布比例(％)分别为25.58±3.70、48.09±2.49、55,26±1.97,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01),组间比较差异亦有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。G2/M期比例39.78±1.55、32.14±1.14、19.42±1.04,与对照组相比及组间比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。 4、1、0.1、0.01 μM 蟾毒灵作用于耐药细胞的凋亡率(％)分别为42.58±2.11、23.27±1.02、18.65±1.36,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);且凋亡率1μM处理组高于0.1μM组(P<0.01),0.1 μM组高于0.01 μM组(P<0.01)。 5、免疫细胞化学法显示耐药细胞可见Bcl-XL、Bax表达。Western blot显示蟾毒灵组Bcl-XL表达较耐药细胞减少,Bax表达增加。 6、蟾毒灵作用后,细胞线粒体膜电位降低(P<0.01);随蟾毒灵作用时间延长,线粒体膜电位逐渐降低,6 h与24 h、12 h与24 h组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。 7、蟾毒灵作用后Caspase-3、Caspase-9活性增强,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01), 加入Caspase广泛阻断剂后,活性减弱(P<0.01),而Caspase-8活性未见明显变化(P>0.05)。蟾毒灵作用6、12、24 h后Caspase-9活性均增强,并在24 h内呈明显的时间、浓度依赖性。 8、蟾毒灵处理后,细胞凋亡率为(25.37±3.16)％,高于对照组(P<0.01):Caspase-9特异性抑制剂组细胞凋亡率为(10.5±2.29)％,低于蟾毒灵组(P<0.01),与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。 9、蟾毒灵对裸鼠原位移植瘤的影响多药耐药裸鼠原位移植瘤模型瘤组织的耐药蛋白TS呈高水平表达。蟾毒灵组肿瘤体积与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.01),蟾毒灵联合5-氟尿嘧啶组与蟾毒灵组比较差异有统计学意义(P<0.05);Tunel法肿瘤组织细胞凋亡率的检测显示,5-氟尿嘧啶组细胞凋亡率为(8.7±3.21)％与生理盐水组(5.4±2.53)％比较差异无统计学意义(P>0.05),蟾毒灵组为(29.7±4.54)％及联合用药组(45.634±5.50)％均高于生理盐水组(P<0.01),蟾毒灵组高于5-氟尿嘧啶组(P<0.01),联合用药组高于蟾毒灵组(P<0.01)。肝肾功能、生化指标蟾毒灵组与生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05),5-氟尿嘧啶组与生理盐水组比较AST及CL-、K+水平差异有统计学意义(P<0.01)。 [结论] 1、人肝癌多药耐药BEL-7402/5-FU细胞株对蟾毒灵无明显的交叉耐药性,蟾毒灵对其具有增殖抑制作用；蟾毒灵对裸鼠原位移植瘤的生长具有显著的抑制作用,对裸鼠心肝肾等脏器无明显毒副作用。2、蟾毒灵能诱导人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU细胞凋亡；3、增加促凋亡蛋白Bax表达、降低抗凋亡蛋白Bcl-XL表达,促进线粒体膜电位耗散继而活化Caspase-9可能是蟾毒灵诱导人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU凋亡的机制之一。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

前 言

第一部分蟾毒灵体外诱导人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU凋亡的作用及机制

一实验材料

二实验方法

三实验结果

四讨 论

第二部分蟾毒灵对裸鼠原位移植性人肝癌多药耐药模型的抗肿瘤作用研究

一实验材料

二实验方法

三实验结果

四讨 论

参考文献

附 图

全文小结

综述：细胞凋亡与肝癌多药耐药的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致 谢