生物样品高通量液相色谱分析方法学研究及其药代动力学应用

摘要

药物代谢动力学旨在通过测定生物样本中的药物或者代谢产物的浓度,定量描述药物进入体内以后的吸收、分布、代谢、排泄过程,进而阐明药物的药效或者毒性,为新药研究的代谢筛选和临床用药的疗效评价提供重要依据。面对不断涌现的大量候选药物,在进行药效学研究的同时,需要进行药代动力学评价,这就要求建立并优化相关分析方法对生物样品中的目标成分(药物、代谢产物、其他外源性成分)进行高灵敏度、快速准确的定量分析。基于反相整体柱的快速分析测定方法、96孔板形式的高通量前处理技术和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高灵敏快速测定方法,本文构建了“准确、灵敏、高通量”的分析策略,并将其应用到新药药代动力学研究中。 一、生物样品高通量分析在药代动力学中的应用进展 临床前药代动力学研究包括动物实验、方法学考察和验证、样品前处理、样品分析、数据处理5个方面,其中大部分和分析方法的建立与应用紧密相连。现代分析科学在药代动力学研究中体现出举足轻重的地位,只有建立可靠、专一、灵敏、快速的生物样品分析方法,才能够实现高通量生物样品分析过程,满足药代动力学研究大样本量的要求。本文对高效液相色谱中整体柱的应用以及基于LC-MS/MS快速分析方法的建立进行了综述。详细介绍了整体柱自身特点以及和传统填料色谱柱的区别,并且对其在药物分析及生物样品测定中的应用进行了回顾,选择高流动相流速即可以实现整体柱上的高通量分析。对于在生物样品高通量分析中占主导作用的LC-MS/MS技术,本文对其样品前处理、基质效应、离子串扰以及样品残留等问题进行了讨论,根据以往研究结果认为采用合适的96孔样品前处理技术不仅可以提高样品前处理过程中的通量,而且有助于改善影响目标成分检测时可能出现的基质效应、样品残留等问题,从而获得准确、灵敏、高通量的生物样品分析方法。 二、反相整体柱液相色谱在药代动力学中的应用研究 本文建立了人血浆中普卢利沙星代谢产物NM394和SD大鼠及Beagle犬血浆中艾迪康唑的反相C18填充柱和反相C18整体柱的快速分析测定方法,考察了常规色谱柱的分析方法转移到整体柱上的适用性,研究整体柱在进行生物样品分析时流动相组成、缓冲液pH值、柱温以及流速对目标成分保留性质的影响,并且对常规色谱柱和整体柱的分析时间及测定结果进行了比较。结果显示,目标成分在整体柱上的色谱行为和在常规色谱柱上相似,方法移植后通过对流动相组成及pH值的微调即可在整体柱上使用。在此基础上建立了Beagle犬血浆中高血压药物氨氯地平和厄贝沙坦同时测定的分析方法,利用整体柱多孔填料的低柱压优势,采用高流速进行色谱分析以缩短测定时间,常规条件下即可实现生物样品的高通量分析。 1、针对人血浆中的NM394,采用Chromolith反相C18整体柱(4.6×100mm)进行色谱分析,流动相组成为乙腈-水(磷酸调pH 3.0)(15:85,v/v),流速为2ml/min,荧光检测激发波长为280nm,发射波长为425nm,柱温25℃。200μl血浆样品用10％高氯酸进行蛋白沉淀后进样分析,结果显示NM394和内标洛美沙星的保留时间分别为3.1和2.3min,生物样品内源性物质不干扰目标成分的测定,每个样品分析周期为4min。与以往方法相比此法缩短了2min,提高了样品分析速度,测定结果和常规方法相当。 2、针对Beagle犬血浆中的艾迪康唑,采用Chromolith反相C18整体柱(4.6×100mm)进行色谱分析,流动相组成为乙腈-20mmol/L NaH2PO4(磷酸调pH3.8)(35:65,v/v),流速为2ml/min,紫外检测波长为230nm,柱温25℃。血浆样品用氢氧化钠碱化后经正己烷液液萃取,艾迪康唑和内标0522的保留时间分别为2.7和3.2min,生物样品内源性物质不干扰目标成分测定,每个样品的分析周期为4min。与以往方法相比此法不仅缩短了分析时间6min,而且提高了检测灵敏度,最低定量限达到10ng/ml。 3、针对治疗高血压的复方氨氯地平厄贝沙坦制剂临床前药代动力学研究的要求,采用Chromolith反相C18整体柱(4.6×100mm)在6.5min内对Beagle犬血浆中的氨氯地平和厄贝沙坦进行分析,流动相组成为乙腈-甲醇-20mmol/L NaH2PO4(磷酸调pH3.0)(25:20:55,v/v/v),流速为2 ml/min,紫外检测波长为238nm,柱温25℃。血浆样品采用Oasis MCX固相萃取小柱进行净化和富集,选择同类高血压药物维拉帕米和替米沙坦分别作为氨氯地平和厄贝沙坦定量分析的内标,氨氯地平、维拉帕米、厄贝沙坦和替米沙坦的保留时间分别为3.0、2.4、4.4和5.4min,血浆内源性物质不干扰目标成分测定,可以满足复方氨氯地平厄贝沙坦制剂的临床前药代动力学研究的需要,并且为高血压药物联合治疗后的血药浓度监测提供了值得借鉴的高通量分析方法。 三、96孔板样品前处理技术在体内药物分析中的应用研究 在LC-MS/MS的应用过程中,本文重点对整个生物样品分析过程中的限速环节--样品前处理进行了方法学的改进和优化,采用96孔板形式对生物样品进行纯化,提高了单位时间内样品通量,实现了大规模样品前处理和液质快速测定的高通量分析。除了常规方法学验证之外,还对基质效应、离子串扰、样品残留等问题进行了探讨,通过选择合适的色谱柱和流动相条件,改进前处理方法等手段,降低或者消除生物样品分析过程中基质效应带来的离子抑制或增强、离子串扰引起的通道干扰和样品残留导致的线性偏移等问题,保证生物样品高灵敏度、高准确度的快速分析。 1、实验采用96孔板对人血浆中的福多司坦进行蛋白沉淀,考察了不同色谱柱上基质效应的影响。所选择的内标化合物厄多司坦由于其与目标成分结构类似,很好的跟踪目标成分在离子源内的变化,保证二者的信号比值不变,增加了定量准确度。与现有方法相比,该方法在样品前处理、检测灵敏度和分析通量上均具有明显优势。简化了样品前处理步骤,提高了样品前处理通量,缩短了色谱分析时间,仅使用50μl血浆,灵敏度达到了0.02μg/ml,并成功地应用于福多司坦的临床药代动力学研究中。 2、实验采用96孔板对Beagle犬血浆中的克伦特罗进行液液萃取,考察叔丁基甲醚、正己烷以及二者的等比混合提取溶剂对血浆样品提取回收率和基质效应的影响。比较了血浆样品纯化后的富集程度对提取回收率和基质效应的影响,结果显示血浆样品提取物稀释1倍后提取回收率没有明显变化,但是离子抑制情况得到了一定的改善。通过在流动相中添加0.01％甲酸,并结合提取过程中的样品稀释,最大程度地减小样品在进样过程中的残留,保证了0.1～10ng/ml范围内血浆标准曲线线性良好。该法同样成功地应用于盐酸克伦特罗双层片和普通片的临床前药代动力学和生物等效性研究中。 3、实验采用Sirocoo蛋白沉淀板对SD大鼠血浆中的抗肿瘤创新药物候选化合物海洋环肽类化合物Phakellistatin 13(PK13)进行快速蛋白沉淀,沉淀后过滤得到的滤液直接进样LC-MS/MS分析。通过比较传统蛋白沉淀方法和沉淀后过滤方法对血浆样品提取回收率和基质效应的影响,发现采用沉淀后过滤的方法可以显著的降低PK13受到的离子抑制,并且提高了样品的绝对回收率,增加了检测灵敏度,能够满足20、50和100μg/Kg静脉注射给药SD大鼠后血药浓度分析的要求,研究结果显示,PK13静注给药SD大鼠后,在体内消除较快,进一步的研究将集中围绕PK13在大鼠体内组织分布及其代谢途径上,探讨PK13进入体内后消除较快的原因。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

第一章生物样品高通量分析在药代动力学中应用进展

第一节反相C18整体柱在药代动力学研究中的应用

1.整体柱的结构特点

2.反相C18整体柱在生物样品分析中的应用

第二节液相色谱-串联质谱在药代动力学研究中的应用

1.LC-MS／MS分析特点

2.基于LC-MS／MS分析的几个问题

3.选题依据与研究内容

参考文献

第二章反相整体柱液相色谱在药代动力学中的应用研究

第一节反相C18整体柱高通量分析人血浆中NM394

1.引言

2.实验方法

3.结果与讨论

4.结论

参考文献

第二节反相C18整体柱高通量分析Beagle犬血浆中艾迪康唑

1.引言

2.实验方法

3.结果与讨论

4.结论

参考文献

第三节反相C18整体柱同时测定Beagle犬血浆中氨氯地平和厄贝沙坦

1.引言

2.实验方法

3.结果与讨论

4.结论

参考文献

第三章96孔板样品前处理技术在体内药物分析中的应用研究

第一节采用96孔板蛋白沉淀高通量分析人血浆中的福多司坦

1.引言

2.实验方法

3.结果和讨论

4.结论

参考文献

第二节采用96孔板液液萃取高通量分析Beagle犬血浆中的克伦特罗

1.引言

2.实验方法

3.结果与讨论

4.结论

参考文献

第三节 高通量分析SD大鼠血浆中海洋环肽Phakellistatin 13

1.引言

2.实验方法

3.结果和讨论

4.结论

参考文献

结语

在读期间发表论文和参加科研工作的情况说明

致 谢

附录