睾丸形态雄激素分泌组织的构建

摘要

一、研究背景 由于先天性疾病、环境污染、工作压力日益加剧和人口老龄化等原因，雄激素缺乏性疾病的发病率具有逐年上升的趋[1]，遗憾的是，针对这类疾病，临床尚无理想的治疗措施。睾丸是男性的重要象征，对维持男性正常生理状态、心理状态都至关重要，这主要源于睾丸的两大功能：一是生殖功能，即产生精子；二是维持男性第二性征，主要通过睾丸间质细胞(Leydig cells，LC)合成并分泌雄激素来实现。因此，睾丸缺失和或雄激素缺乏，都将带给男性巨大的创伤。另外，睾丸外观或功能异常对男性心理也会造成很大影响。因此，针对睾丸缺失和/或功能障碍，必须从外观和功能两方面治疗。 组织工程技术的发展为重建能够接受体内生理性调节的雄激素分泌组织提供了可能LC分离纯化技术的成熟，为细胞移植治疗雄激素缺乏症带来了希望[2-4]。大量研究表明，LC移植后，在一定时期内可以在受体内产生雄激素，发挥补充替代作用，甚至某些研究已将其用于男性性功能低下患者的治疗[5-8]。但这些方法在应用中也遇到很多问题：(1)雄激素分泌功能维持时间短暂。这可能与细胞移植后缺乏适宜的生长载体和生长环境有关[9-10]；(2)不能重建睾丸外观。单纯细胞移植无法形成具有一定体积和形态的睾丸组织。这些问题的存在，严重限制了细胞移植技术的推广应用，探索更符合生物学原则的治疗方法将是解决这些问题的关键。组织工程技术为解决这一难题提供了新策略，其基本原理是将少量种子细胞经体外扩增后与生物载体结合，在体内或体外构建具有一定形态和生理功能的组织甚至器官。因此，应用组织工程技术构建具有一定形态和功能的睾丸组织，将是研究和治疗这类特殊疾病的新途径。本课题指导小组在前期已成功联合应用复合胶原酶及差速贴壁法分离出LC并研究其培养体系、睾丸内贴壁体细胞共培养体系并得出结论睾丸微环境对LC具有营养支持作用、睾丸内贴壁体细胞同基因鼠体内移植可构建出雄激素分泌组织[11]；本课题将在其基础上构建具有睾丸外形的雄激素分泌组织，为雄激素缺乏、睾丸缺失性疾病提供一个更符合生理、更理想的治疗方法。 二、研究目的 1、对种子细胞进行标记的可行性。 2、具有分泌功能的睾丸形态雄激素分泌组织在同基因动物体内构建的可行性。 三、研究内容和方法 1、取80±20克(3周龄)雄性Wister大鼠双侧睾丸，联合应用复合胶原酶消化及差速贴壁法，分离培养睾丸体细胞。 2、用Q-dot对部分睾丸体细胞进行标记。。 3、取80±20克(3周龄)雄性Wister大鼠，经阴囊去势制备去势鼠(等待饲养4周后回植)。 4、取Wister大鼠功能良好的睾丸体细胞按实验分组与有或无Medpor内核的PLA+PGA生物支架分别复合，形成“细胞-生物材料”复合物。实验分组：Medpor-PGA+PLA复合支架组(n≥6)：2×107睾丸体细胞：PGA+PLA对照组(n≥6)：2x107睾丸体细胞；空白组(n≥6)：无细胞组；假手术组(n≥6：无细胞无材料组)。按分组将复合物、空载分别回植于已去势4周的Wister大鼠阴囊内，回植后3月、6月取材，测定血清睾酮水平及移植物行大体观察及HE组织学染色。 四、研究结果 1、体外培养观察： 量子点易于标记睾丸体细胞，不排出胞外，荧光发光度强容易观察，体外培养十余天、传代后荧光仍未观察到衰减，证明量子点标记睾丸体细胞可行。 2、体外培养取材后观察： 最长在体内培养21周后仍能观察到组织块中的量子点红光标记，测血睾酮仍有激素分泌，说明标记物可较长期标记，不会轻易丢失在体内培养后标记物也可以较长期存在，不影响组织块形成、激素分泌，但红光强度减弱。 3、睾丸体细胞复合睾丸形态的medpor-可降解生物材料形成的复合物回植入体内后可形成组织块，组织块具有睾丸形态，并具有分泌雄激素的功能。 4、睾丸体细胞复合可降解生物材料的复合物回植入体内后维持较高水平的雄激素分泌功能，可达六月之久认不衰减，再次印证了用本课题组前期发现的方法分离的睾丸体细胞是构建雄激素分泌组织的优良种子细胞来源。 5、睾丸形态的复合物回植体内在3月时我们选用的材料内核与PGA/PLA层比例是合适的，它既能维持睾丸形态，又能保证较高水平的雄激素分泌。而在更长时期的体内培养中材料内核与PGA/PLA层比例还有待于进一步摸索，总之睾丸体细胞与睾丸形态的生物材料支架复合回植体内维持形态保持激素较高水平分泌是可行的。 五、研究结论 量子点作为标记物标记睾丸体细胞可行，可作为构建具有雄激素分泌功能的组织工程睾丸的种子细胞的标记物。以医用多孔高密度聚乙烯(Medpor)为内支撑外裹聚羟基乙酸(PGA)，接种睾丸体细胞复合成“细胞-材料复合物”后于体内构建睾丸形态的Medpor-睾丸体细胞复合体在12周时激素分泌高于对照组。但在24周时激素分泌统计学表明无内支撑比有内支撑结构激素维持好。因此，认为构建具有睾丸形态雄激素分泌功能的组织工程化组织是可行的，但保持睾丸形态又能维持长期高水平激素仍需进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写

声明

前言

第一部分量子点对睾丸体细胞标记的可行性研究

一、材料与方法

二、结果

三、 讨论

第二部分 组织工程化睾丸形态雄激素分泌组织构建的可行性初步研究

一、 材料与方法

二、 结果

三、讨论

全文结论

参考文献

综述 半导体量子点在细胞标记领域的应用进展

硕士期间科研业绩一览表

致谢