SELDI质谱技术在乳腺癌早期诊断中的应用研究

摘要

研究背景与目的： 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，1995-2004全球女性乳腺癌的发病率位于第一位，死亡率仅次于肺癌位于第二位[1]。中国肿瘤登记处2004年中国女性肿瘤发病率第一位为乳腺癌，成为女性发病率最高的恶性肿瘤，并且据中国肿瘤登记处统计，乳腺癌的死亡率排在中国城市女性肿瘤死亡率的第四位[2]。目前乳腺癌治疗的10年以上生存率尚无明显改善，主要原因是大部分患者发现时已到中晚期。乳腺癌的自然病程以临床前期最长，约占疾病全程的2/3，早期癌中多数尚未出现明显包块或肿块较小，待乳房出现明显肿块时，半数以上已有淋巴或血行转移。因此，探索灵敏的乳腺癌早期诊断方法，对乳腺癌的治疗、改善预后和生存质量的提高均有重要的意义。 传统的乳腺检查方法有：X线乳房摄片、B型超声检查、红外线乳房摄像、选择性乳腺导管造影、针吸细胞学检查等，这些方法对于具有明显包块的患者诊断准确率约为57％～85％[3]，但对于肿瘤直径小于0.5cm，特别是临床未扪及明显肿块的早期乳腺癌患者，目前传统检查方法的特异度及阳性率不高，准确率大为降低。 因此，寻找一种高度敏感、特异的早期诊断乳腺癌的方法成为目前临床的迫切需要。差异蛋白质组学的发展为肿瘤的研究提供了新的研究方式。肿瘤细胞在病理发展过程中，必然会产生和正常组织细胞不一样的蛋白质，如果能将这种蛋白质组的差别正确地进行分析，势必能够寻找到一种新的诊断肿瘤的方法。表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization- time of flight-mass spectrometry，SELDI-TDF-MS)技术是近年发展起来的一种蛋白组学研究方法。以这一技术为基础开发的蛋白质芯片可以非特异性或特异性地结合被测样本中的各种蛋白质，当在质谱仪中受激光轰击时，各种结合的蛋白质会被激发而形成气化离子，由于不同质荷比的离子在电场中飞行时间长短不一，因此通过接收装置及数模转换可将不同质荷比的蛋白质及其量的多寡直观地用位置、强弱不同的峰表现出来，进而形成图谱来分析。利用这种技术可对血清、尿液、细胞裂解液等生物样品直接进行检测，且具有高灵敏度及高通量性的特点，能基本反映被检样本中蛋白质的全貌，进而可以发现蛋白质的变化，为早期诊断、预后估计、复发或转移的监测提供了可能。本研究旨在利用Ciphergen公司的蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统，选择铜离子蛋白芯片，对乳腺癌和乳腺良性病患者及正常人血清差异表达蛋白进行分析，探讨建立可用于乳腺癌早期诊断的分类模型。 方法： 采用美国Ciphergen公司的固化金属螯合(immobilized metal affinity capture，IMAC30-Cu2+)蛋白质芯片和表面增强激光解析电离飞行时间质谱仪，检测46例乳腺癌、40例乳腺良性病患者及40例正常人血清进而获得血清蛋白质谱图，将获得的蛋白质谱图用Ciphergen公司的Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析，通过交叉验证建立起乳腺癌早期诊断的分类树模型，并另将含有10例正常人、10例乳腺癌、10例乳腺良性病的验证组共30例对此模型进行盲法验证。 结果： 对46例乳腺癌患者、40例乳腺良性病患者及40例正常人血清蛋白进行分析，结果发现共有22个蛋白表达量存在统计学差异(P＜0.05)，且此22个差异蛋白在乳腺癌患者血清中含量均低于正常人；通过Biomarker Pattern软件进行分析组合，以其中10个蛋白(质荷比分别为M3162.32、M3960.93、M4213.3、M4526.43、M15908.15、M5386.11、M11383.4、M11735.4、M13892.1、M6007.7)组成了最佳分类树模型，分组准确率达到98.41％(124/126)，灵敏度及特异度为100％(46/46)和97.5％(78/80)。将包括乳腺癌10例、乳腺良性病10例、正常人10例的验证组对此模型进行盲法验证，结果该模型诊断乳腺癌的准确率、灵敏度及特异度分别是83.33％(25/30)、80％(8/10)、85％(17/20)。 结论： 乳腺癌患者与正常人血清中有22个蛋白含量差异显著。且乳腺癌患者差异蛋白含量较正常人明显偏低，提示它们在肿瘤发生、发展过程中受到了抑制，或者是由于这些蛋白质含量的降低直接或间接导致了癌症的发生。 运用SELDI技术，采用差异蛋白质组学的方法建立起乳腺癌的早期诊断模型。此方法较之以往早期诊断乳腺癌的技术，敏感性大大提高，若行进一步验证及临床实验，有望成为早期诊断乳腺癌的新的技术手段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略语对照

声明

前言

第一部分：SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片仪工作原理

一、蛋白芯片阵列

二、蛋白质芯片的制备

三、蛋白质芯片阅读仪

四、蛋白质芯片软件控制分析系统

第二部分：SELDI质谱技术在乳腺早期诊断中的应用研究

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

文献综述：SELDI-TOF-MS技术检测乳腺癌血清特异性蛋白质进展

致谢