急性移植物抗宿主病环境对供体来源正常造血干/祖细胞功能的影响

摘要

目的:造血干细胞是所有成熟血细胞的来源。异基因造血干细胞移植现已成为治疗良、恶性血液系统疾病、一些实体瘤、某些自身免疫性疾病的重要手段。但移植过程中及移植后的并发症仍是导致影响患者生活质量、导致患者死亡的重要因素，其中最突出的并发症为急性移植物抗宿主病(acute gaft-versus-host disease，aGVHD)。aGVHD是供体T淋巴细胞与受体组织之间的免疫反应，其病理生理机制为植入的供体免疫活性细胞被宿主抗原致敏而激活、增殖分化从而导致宿主靶器官损害[1]。临床实践中我们发现，重度急性GVHD的患者(Ⅲ-Ⅳ度)，多出现一系、两系甚至全血细胞减少，对刺激造血因子治疗反应欠佳，且无法从根本上解决问题。研究证实急性GVHD是造血功能低下的主要危险因素，而GVHD患者出现血小板减少是预后差的因素之一。目前少有研究涉及造血干细胞移植后GVHD患者体内供体来源正常造血干细胞数量和功能变化。因此，本课题以半相合造血干细胞移植后急性GVHD为模型，研究急性GVHD环境中供体来源正常造血细胞数量和功能变化。 研究方法：小鼠造血干细胞移植供体小鼠：C57BL/6(H-2b)。受体小鼠：CB6F1(BALB/c×C57BL/6：F1)(H-2b/d)。小鼠半相合移植模型受体小鼠移植前接受8Gy一次照射，随机分为三组。空白对照组仅接受输注PBS。GVHD组每只受体小鼠移植C57BL/6来源的骨髓细胞5×106、脾脏细胞6×107。正常移植对照组每只小鼠仅移植C57BL/6来源的骨髓细胞5×106。HSC/HPC数量以Lin-c-Kit+ Sca-1+(LKS)为造血干细胞(HSC)的表型，Lin-c-Kit+Sca-1-(LKS-)为造血祖细胞(HPC)的表型。移植后不同时间点流式细胞术分别检测正常对照和GVHD小鼠体内HSC和HPC的数量。集落形成单位(CFU)检测移植后2周取GVHD组和正常移植对照组全骨髓细胞进行CFU检测，14天后显微镜下计数集落数，每组8个复孔。鹅卵石样细胞形成(CAFC)实验移植后2周，GVHD组和正常移植对照组全骨髓细胞，用MyeloCultTM M5300培养基重悬。分为1×105，5×104，2.5×104，1.25×104，6.25×103，3×1036个剂量组，以原代骨髓基质细胞作为饲养层，并按设计浓度加入测试细胞，33℃，5％CO2条件下连续培养5周。取d35 CAFC数据计算不同造血环境中CD45.1+细胞的CAFC频率。细胞凋亡分析移植后2周，用Annexin V-PE试剂盒结合HSC/HPC细胞标记(Lin-)，流式细胞术检测两组HSC/HPC的凋亡水平。HSC/HPC归巢相关因子CD44表达水平移植后不同时间点流式细胞术检测HSC/HPC中CD44表达率。HSC/HPC细胞周期采用BrdU试剂盒，结合HSC/HPC标记，检测GVHD小鼠HSC/HPC的细胞周期状态。T细胞植入检测分别检测供体脾细胞及移植后5天、7天、11天、14天受体骨髓细胞中CD3、CD4、CD8比例。统计学分析计量资料比较采用Student t test，计数资料比较采用χtest。最大似然法采用统计软件L-Calc分析，生存资料采用Prism4.0软件分析。 结果：成功建立小鼠半相合移植急性移植物抗宿主病模型急性GVHD组小鼠移植10天后逐渐出现腹泻、血便、体重减轻、脱毛、弓背等表现，中位生存时间14天(4～18天)；对照组除死于放射后并发症外(n=1)，其余均存活。急性GVHD的发病率为100％。急性GVHD环境中HSC/HPC数量显著低于正常移植对照组移植后2周，LKS(Lin-c．Kit+Sca-1+)比例分别为12.42×10-4和82.55×10-4(P=0.02)；LKS-(Lin-c-Kit+Sca-1-)分别为6.46％和1.66％(P=0.015)，Lin-分别为12.46％和3.66％(P=0.0011)。急性GVHD环境中供体来源正常造血细胞CFU形成能力显著下降移植后2周，相比正常移植对照组，急性GVHD组造血细胞集落形成能力均有不同程度下降，CFU-G[(7.54±1.60)vs(3.5±1.19)，P＜0.001]，CFU-M[(5.9±1.36)vs(3.6±1.41)，P=0.006]、CFU-GM[(2.6±0.74)vs(2.2±0.64)，P=0.172]、CFU-Mix[(1.5±0.53)vs(0.5±0.53)，P=0.002]，对照组CFU总数约为aGVHD组的2倍[(17.5±2.07)vs(9.75±2.12)，P=0.0000034]。以上数据说明在急性GVHD环境中，集落形成单位(反映HPC频率)明显下降或单位祖细胞克隆形成能力下降。急性GVHD环境中造血细胞CAFC频率下降移植后2周，极限稀释法连续体外培养CAFC5周后，计数。急性GVHD组CAFC频率为1/991，147，对照组为1/335，229。对照组造血细胞的CAFC频率约为急性GVHD组的3倍(P＜0.05)。CAFC是HSC频率的体外替代实验，此数据说明aGVHD环境中HSC频率明显下降。急性GVHD环境下HSC/HPC凋亡比例增加不明显相比于对照组，移植后2周急性GVHD环境中正常Lin-细胞群凋亡比例仅略升高，分别为(13.8±1.21)％和(8.73±1.39)％(P=0.48)。结果说明，急性GVHD并不直接增加HSC/HPC凋亡比例，GVHD宿主各类早期细胞的减少，并不由于其生存时间缩短引起。急性GVHD组HSC归巢相关分子CD44表达增高移植后不同时间点GVHD组受鼠LSK细胞CD44表达均较对照组高(P＜0.03)。急性GVHD组移植后早期HSC/HPC进入S比例显著升高发生急性GVHD的宿主HPC(Lin-Sca-1+)在16小时内进入S期的比例显著增高(3.58％vs1.51％，P＜．001)，而这一增殖过程在移植后72小时停止，而以其下游的Lin-细胞为主(18.72％vs9.24％，P＜．001)。 结论：1．首次证明在急性GVHD环境中，正常HSC/HPC数量显著低于正常移植对照组，且体外CFU和CAFC等克隆形成能力显著下降。结果提示，急性GVHD的发生能直接抑制正常HSC/HPC增殖，但并不缩短正常LKS的生存时间。2．首次证实发生急性GVHD的宿主HPC出现一过性扩增，由于HSC的增殖潜能受到抑制，HSC不能充分增殖分化形成更多的HPC补充HPC池，导致了HPC耗竭，从而引起终末分化的成熟细胞减少。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

引言

第一部分 小鼠半相合急性移植物抗宿主病模型的建立

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二部分 供体来源正常造血干/祖细胞在急性移植物抗宿主病环境中受抑

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第三部分 GVHD环境对正常造血系统影响机制的初步研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文总结

综述 异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病生物学研究进展

致谢