糖皮质激素对人中性粒细胞脱颗粒的快速抑制作用及其分子机制研究

摘要

糖皮质激素(glucocorticoid，GCs)是由肾上腺皮质分泌的甾体激素，GCs具有调节免疫、代谢、生长发育等多种生理和药理作用，并参与行为和认知过程的调节。糖皮质激素可以通过基因组和非基因组两种机制发挥作用。与基因组效应相比，GCs的非基因组效应具有以下特点：a．效应发生的时间短，恢复快(数秒到数分)；b．效应不能被转录/蛋白合成抑制剂或类固醇激素受体拮抗剂所阻断；c．偶联某些大分子物质(如BSA)不能通过细胞膜的糖皮质激素，也可以发生的效应；d．在缺少细胞核或不能进行RNA和蛋白质合成的细胞内(如红细胞、精子、培养的胚胎海马神经元)也可以发生的效应；e．糖皮质激素与不具有激活转录活性的突变受体结合后仍能发挥的效应。GCs基因组作用的机制目前已经有了较深入的研究，但对非基因组机制的了解大多还只停留在快速效应现象上，对于非基因组效应的分子机制目前并不是十分明确，目前发现很多分子参与了其信号转导，如PI3K、蛋白激酶AKT、Lck\Fyn、jnk、p38、PKC、cAMP、IP3等，作用于不同的细胞机制并不一样。 中性粒细胞(neutrophil，又称多形核白细胞，polymorphonuclear leukocyte，PMN)是人体内非常重要的免疫细胞，是宿主防疫外来病原入侵的第一道防线。PMN被活化后，主要通过呼吸爆发(释放氧自由基)和脱颗粒(释放多种蛋白水解酶)发挥杀菌功能。但当PMN激活过度时，又能导致组织损伤、引发很多的疾病，比如类风湿性关节炎、缺血再灌注损伤、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等等。而抑制中性粒细胞的过度活化可以改善这些炎性疾病，大剂量糖皮质激素是治疗这类严重炎性疾病的重要手段，我们推测大剂量的GCs可能是通过抑制PMN的过度激活来发挥作用的。我们前期的实验验证了这一推测，体外大剂量的能在五分钟内快速抑制中性粒细胞脱颗粒，用GCs核受体拮抗剂RU486和转录/蛋白合成抑制剂放线菌酮均不能阻断这种效应，提示糖皮质激素的这种抑制效应是通过非基因组机制起作用。 PMN脱颗粒的机制非常复杂，不同刺激物的信号转导途径并不一样，同一刺激物也可以通过多条途径激发细胞脱颗粒，不同途径之间又相互影响和联系，形成一个复杂的网络。甲酰三肽(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)刺激PMN脱颗粒主要通过以下几条途径：(1)受体酪氨酸激酶信号转导途径；(2)磷脂酶-PKC信号转导途径；(3)cAMP-PKA信号转导途径；(4)NO，cGMP-PKG信号转导途径；(5)PKB信号转导途径等等。 cAMP是调节PMN活性的非常重要的第二信使。研究证明，升高胞内cAMP水平可以抑制PMN的活性，而降低胞内cAMP水平或者抑制cAMP依赖的PKA活性则可增强PMN的活性。胞内cAMP水平取决于腺苷酸坏化酶(AC)和cAMP专一的磷酸二酯酶(PDE)的活性，AC催化ATP产生cAMP，而PDE则可水解cAMP。细胞膜上有受体、G蛋白和AC三种蛋白质，胞外刺激性信号或抑制性信号与刺激性或者抑制性受体(Rs或者Ri)结合，通过偶联的刺激性或者抑制性G蛋白(Gs或者Gi)传递给AC，激活或者抑制AC。当AC被激活时，胞内cAMP水平升高，通过蛋白激酶A(PKA)使蛋白磷酸化，进而调节细胞反应，不同细胞PKA的底物蛋白不同，所以产生的效应也不同。cAMP很快被PDE分解，信号被灭活。PDE共分为九型，在不同的组织和细胞中都有表达，不同组织和细胞的PDE亚型不一样。cAMP专一的PDE亚型是第四亚型，PDE4又分为四个亚型，分别为A、B、C、D亚型，每个亚型由不同的基因表达。人中性粒细胞和单核细胞主要表达PDE482。 本实验采用Percoll不连续梯度密度离心法分离纯化人外周血PMN，以fMLP为刺激物激发PMN脱颗粒，采用酶反应比色法和ELISA法检测PMN颗粒标志物髓过氧化物酶和乳铁蛋白，采用放免法检测PMN胞内cAMP水平，用比色法测定PDE活性，探讨GCs抑制人PMN脱颗粒的信号通路及其作用的靶点。检测了GCs预处理五分钟以及GCs预处理后fMLP刺激五分钟后PMN胞内cAMP水平；PKA抑制剂H89预处理后对GCs抑制fMLP刺激的PMN脱颗粒的影响；细胞经穿孔处理后兴奋性G蛋白(Gs)阻断剂GDPβ对GCs抑制fMLP刺激的PMN脱颗粒的影响；用甲基-β-环糊精破坏细胞膜脂筏结构对GCs抑制fMLP刺激的PMN脱颗粒的影响以及GCs对PMN的PDE活性影响。 主要取得了以下结果： 1．GCs可显著升高PMN胞内cAMP水平； 2．cAMP依赖的PKA抑制剂H89可以逆转GCs对PMN脱颗粒的抑制作用； 3．PMN经化学穿孔后，兴奋性G蛋白(Gs)阻断剂GDPβs不能逆转GCs对PMN脱颗粒的抑制作用； 4．fMLP增强PMN的PDE活性，GCs抑制PMN的PDE活性； 5．甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin，MβCD)不能逆转GCs对PMN脱颗粒的抑制作用。 综上可以发现，大剂量糖皮质激素抑制人外周血中性粒细胞脱颗粒的信号通路之一为cAMP-PKA途径，其作用靶点为PDE，通过抑制PDE的活性升高胞内cAMP水平而起作用，这种非基因组作用不是作用于细胞膜上兴奋性G蛋白偶联受体或者胞内经典的GCR，也可能不是作用在细胞膜脂筏结构。

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糖皮质激素非基因组效应及其机制(综述)

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