一氧化氮合酶对大鼠梗死心肌内移植细胞存活的作用及其机制研究

摘要

目的：急性心肌梗死为常见病，且发病率仍逐年上升。目前尚无特效修复坏死心肌，改善心功能的方法。近年来，细胞移植疗法受到广泛的关注。虽有研究报道骨髓间质干细胞在体内具有多功能细胞分化的潜能，但采用细胞移植治疗心肌梗死存在移植细胞存活率极低或大量移植细胞死亡限制了其临床应用。由iNOS催化合成高浓度的NO被认为是导致心肌缺血坏死的重要因素之一，但其与移植细胞凋亡的关系尚不清楚。iNOS表达于心肌梗死后1h、3d，7d分别表现为不明显、达高峰、回落等变化。为此，采用动物实验与对照研究法，将SD雄性大鼠骨髓间充质干细胞移植于不同时间的雌性大鼠心肌梗死模型，观察iNOS表达与移植细胞存活生长的变化，以探讨适合心梗后细胞移植治疗的最佳时间选择，明确iNOS表达与移植细胞凋亡的关系以及iNOS特异性抑制剂对移植细胞存活及心肌修复的影响，进而分析明确iNOS对移植细胞存活的作用机制，为临床应用干细胞移植治疗心肌梗死与优化治疗方案提供必要的科学依据。 方法：1．实验动物模型及分组：SD大鼠，体重150～180 g。模型制备：开胸，于左心耳下2mm处永久结扎左冠状动脉前降支，复制急性心肌梗死模型。依据细胞移植的开始时间分为三个组：A组：于心肌梗死后1小时进行细胞移植；B组：于心肌梗死后3天进行细胞移植；C组：于心肌梗死后7天进行细胞移植。三个组均在细胞移植后七天取材检测。2．骨髓间充质干细胞(MSC)的分离培养：使用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs并检测表面表志物CD34、CD44表达来鉴定细胞。使用Hoechst33342、BrdU标记细胞并应用免疫荧光染色鉴定标记结果。3．细胞移植：再次开胸，将2.4X106个MSC注射移植于梗死区中部心外膜下。4．移植细胞检测：细胞移植后第7天取材，(1)H-E染色(石蜡切片、冰冻切片)，均以受体动物心脏的细胞移植区为目标，连续切片，每隔5张取1张切片，共取10张切片进行染色。(2)Brdu特异性抗体免疫组化检测，观察移植MSCs在心肌梗死区的定位与分布。(3)Hoechst33342荧光标记检测：观察移植MSCs在心肌梗死区的定位与分布。(4)半定量RT-PCR检测Y染色体性别决定区sry基因，取大鼠梗死区组织，抽提DNA，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。(5)实时定量PCR检测Y染色体性别决定区sry基因：检测雌性受体大鼠心肌梗死区的雄性供体大鼠细胞存活率。(6)移植细胞TUNEL凋亡检测；5．iNOS表达测定：(1)免疫印迹检测：取梗塞部位组织。(2)免疫组化检测。6．iNOS选择性抑制剂1400W干预：以实时定量PCR检测Y染色体性别决定区sry基因定量分析结果为依据，选取移植细胞存活最差组和最好组，分别于细胞移植前12小时给予1400W，1.125mg/kg，腹腔注射，2次/1日，维持3天，于细胞移植后7天取材。 结果：1．BMSC鉴定：流式细胞仪检测第四代BMSCs的CD34、CD44的阳性百分率分别为0.9％和90％，免疫组化检测有CD44表达，而无CD34表达，证明实验细胞为BMSCs。2．心肌梗死模型：结扎前降支后，心脏膨大，缺血区呈苍白色且搏动减弱，与未缺血区界线清楚。3梗死区移植细胞存活的病理学证据：(1)H-E染色见梗死第7天，心肌梗死区成纤维细胞增生。移植细胞区域被梗死纤维组织包绕，呈椭圆形，细胞排列成团，核大染色深，胞质比例小；(2)Brdu标记见BMSCs移植实验组梗死区呈棕黄色阳性细胞核聚集。(3)Hoechst33342荧光标记见BMSCs移植实验组梗死区蓝色荧光信号聚集，表明细胞成功移植于大鼠心肌梗死区。4．梗死区移植细胞存活的分子生物学证据：(1)Y染色体性别决定区sry基因RT-PCR： BMSCs移植实验组大鼠心肌梗死区Y染色体性别决定区sry基因显表达阳性，证明有BMSCs移植存活，且心肌梗死1小时细胞移植组和7天细胞移植组sry基因表达均高于3天细胞移植组。(2)Y染色体性别决定区sry基因实时定量PCR：心肌梗死1小时和7天细胞移植实验组在移植后第7天的细胞存活率显著高于心肌梗死3天细胞移植实验组(6.2％和8.3％vs2.1％，n=8，p＜0.01)。5．梗死区iNOS表达：(1)免疫组化显示iNOS表达强度为，心肌梗死3天细胞移植组＞1小时组＞7天组(n=5，p＜0.01)；(2)免疫印迹检测iNOS表达：a．正常心肌组织：无iNOS表达；b．心肌梗死后不同时间iNOS表达的强度规律：为3天＞1小时＞7天＞10天＞14天(n=5，p＜0.05)；c．心肌梗死后不同时间细胞移植，在移植后7天iNOS表达的强度为：心肌梗死3天细胞移植组＞1小时组＞7天组(n=5，p＜0.05)；d．心肌梗死后7天细胞移植，移植后不同时间iNOS表达的强度规律：为3天＞1天＞5天＞7天(n=5，p＜0.05)。6．iNOS选择性抑制剂1400W对移植细胞的保护作用：(1)心肌梗死3天细胞移植：治疗组细胞移植区Hoechst33342蓝色荧光标记信号强度高于生理盐水对照组； TUNEL免疫组化DAB显色：治疗组细胞移植区凋亡核阳性比低于生理盐水对照组；Y染色体性别决定区sry基因RT-PCR：治疗组表达强度高于生理盐水对照组，实时定量PCR：Y染色体性别决定区sry基因表达显著强于对照组(4.2％vs1.8％，n=5，p＜0.05)。免疫组化示治疗组iNOS表达弱于对照组；免疫印迹示治疗组。iNOS表达低于对照组(35％vs8％．n=4，p＜0.05)。(2)心肌梗死7天细胞移植：治疗组细胞移植区Hoechst33342蓝色荧光标记信号强度低于生理盐水对照组；TUNEL免疫组化DAB显色：治疗组细胞移植区凋亡核阳性比高于生理盐水对照组；Y染色体性别决定区sry基因RT-PCR：治疗组表达强度低于生理盐水对照组；实时定量PCR：Y染色体性别决定区sry基因表达显著低于对照组(11.5％vs4.6％，n=7，p＜0.05)。免疫组化示治疗组iNOS表达略强于对照组；免疫印迹示治疗组iNOS表达与对照组无显著差异(33％vs30％，n=4，p＞0.05)。 结论：1．于心肌梗死后第7天进行大鼠BMSC移植治疗效果最佳，移植细胞存活率8％。2．iNOS表达高峰在心肌梗死第3天或移植后第3天，随后下降；3．iNOS选择性抑制剂1400w能显著提高心肌梗死后3天细胞移植组的移植细胞成活率，但是，却显著降低心肌梗死后7天细胞移植组的移植细胞成活率。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分骨髓间充质干细胞培养、鉴定及标记

1.材料和方法

1.1实验动物

1.2主要试剂

1.3主要仪器及耗材

1.4 MSCs培养

1.5 MSCs的鉴定

1.6 MSCs的标记

2.结果

2.1骨髓间充质干细胞的分离、纯化和培养

2.2 MSCs分子标志物检测鉴定

2.3 MSCs标记物的检测鉴定

3.讨论

第二部分心肌梗塞模型的构建

1.材料和方法

1.1实验动物

1.2主要试剂和仪器

1.3急性心肌梗死模型制备

1.4心肌梗死模型各项指标的检测

2.结果

3.讨论

第三部分骨髓间充质干细胞移植后存活情况的观察

1.材料和方法

1.1主要试剂

1.2主要仪器

1.3实验动物分组

1.4移植细胞在心肌梗死组织中的存活情况

2.结果

2.1形态学观察

2.2免疫组织化学检测

2.3半定量PCR与实时定量PCR检测移植细胞存活情况

3.讨论

第四部分iNOS对大鼠梗死心肌内移植细胞存活的作用

1.材料和方法

1.1主要试剂及仪器

1.2主要试剂配制

1.3实验动物分组

1.4各组实验动物的制备

1.5 Western blot检测iNOS的表达情况

1.6梗死心肌中移植细胞与iNOS表达的关系

1.7 Quantitative real-time PCR检测各组移植细胞存活情况

2.结果

2.1iNOS在不同时间的表达

2.2HE染色结果

2.2免疫组化检测移植细胞存活与iNOS表达的关系

2.3诱导型一氧化氮合酶选择性抑制剂对各组移植细胞存活的作用

3.讨论

3.1 iNOS的表达与心肌梗死

3.2 iNOS的表达与移植MSCs成活率的关系

3.3 iNOS表达与MSCs移植时间

3.4 iNOS表达程度与心肌损伤的关系

3.5 NOS对大鼠梗死心肌区移植细胞存活的作用途径

参考文献

全文小结

创新点和意义

综述 干细胞治疗缺血性心脏病的研究进展

致谢