一氧化氮合酶干预对大鼠梗死心肌内移植细胞存活性及心功能的影响

摘要

目的：急性心肌梗死作为常见的心血管疾病，严重威胁着人类的生命。大量研究表明，骨髓干细胞移植治疗心肌梗死，能明显修复受损的心肌，诱导新生血管形成，改善心功能。但仍然存在移植细胞早期大量丢失，移植时机选择等问题，限制了其临床应用。心肌梗死发生后，心肌组织缺血缺氧，大量有害的细胞因子和炎症介质被释放，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性被激活，可能是导致移植细胞大量死亡的主要原因。为此，我们通过动物实验，在心梗后不同时间点，将雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞移植至雌性大鼠心肌梗死模型内，观察移植细胞在梗死区的存活情况和心功能变化，探讨适合心梗后细胞移植治疗的最佳时间选择。并进一步通过实验观察心肌梗死后iNOS的表达变化规律，在此基础上，观察早期的iNOS 抑制剂干预对移植细胞存活率及心功能的影响，明确其对移植细胞存活及心肌修复的作用，为干细胞移植治疗心肌梗死的临床应用提供必要的科学依据。
　　 方法：1、急性心肌梗死（AMI）模型的制备：取体重150-180g、雌性SD大鼠，采用永久性结扎冠状动脉前降支的方法制备AMI 模型，根据细胞移植时间不同随机分组进行实验观察。2、骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养：取体重100～130g、雄性SD大鼠，使用全骨髓贴壁法分离、培养MSCs，并采用免疫细胞化学和流式细胞术对培养的MSCs 进行鉴定。3、细胞移植：根据细胞移植时间点的不同行原位二次开胸，直视下将培养的MSCs （约1.2×106个）注射植入到梗死区中部心外膜下。4、移植细胞的定位检测：使用Hoechst33342和BrdU对移植的细胞进行标记，免疫组织化学检测与HE 染色相对应，观察移植细胞在心梗区的定位及分布。5、移植细胞的定量检测：采用实时定量PCR 检测雌性大鼠梗死区Y 染色体性别决定区sry基因序列的表达，作为检测移植细胞存活率的定量比较指标。6、心功能的检测：细胞移植后4周，对实验大鼠行心脏超声检查。7、心梗区iNOS表达规律的检测：采用Western-blot 检测心肌梗死后1h、3d、7d、10d、14d 梗死区的iNOS表达情况。
　　 结果：1、MSCs 鉴定：分离纯化的第四代MSCs 经免疫细胞化学检测有CD29和CD44表达，无CD34表达，经流式细胞仪检测为CD44+/ CD34-，证明实验细胞为MSCs。2、心肌梗死模型：冠状动脉前降支结扎后，左室前壁变苍白，心脏膨大，左心耳充血，心室收缩减弱，与未梗死区界线清楚，表明心肌梗死动物模型制备成功。3、移植细胞存活情况和心功能观察：实验大鼠随机分为4组，心肌梗死（MI）组：心肌梗死后不进行MSCs 移植，于心梗后4周行心功能检测作为对照；1h 移植组：于心肌梗死后1h 行MSCs 移植，移植后立即取材作为Y 染色体sry基因检测的对照标本；3d 移植组：于心肌梗死后3d 行MSCs 移植；7d 移植组：于心肌梗死后7d 行MSCs 移植。3d组和7d组均于移植后4周行心功能、移植细胞存活率及组织学检测。Real-time PCR 检测心肌梗死后7d 移植组MSCs 存活率明显高于3d 移植组，MSCs存活率分别为8.1％、2.5％（n=10，p<0.05）。心功能检测发现，在MSCs 移植后4周，与MI组相比，3d 移植组左室舒张末期内径（LVDd）和收缩末期内径（LVDs）无明显缩小，左室短轴缩短率（FS）和左室射血分数（EF）也无明显提高，两组无显著性差异（n=10，p>0.05）。而7d 移植组在细胞移植后4周，LVDd和 LVDs 较3d 移植组和MI组均有明显缩小，FS及EF 也明显提高，与3d 移植组和MI组相比具有显著性差异（n=10，p<0.05）。组织学检测发现，1h 移植组：Hoechst33342 标记及BrdU阳性的细胞主要分布于移植区域，细胞形态无变化；3d 移植组：细胞移植后四周，梗死区Hoechst33342 标记及BrdU 阳性的细胞数量较少；7d 移植组：在梗死区有大量的带有蓝色荧光的移植细胞分布，部分细胞聚集形成血管样结构。BrdU免疫组化染色及相应的HE 染色同样发现在心肌梗死区有大量的移植细胞成团聚集，部分血管内皮可见BrdU 阳性细胞，提示移植的MSCs在宿主心肌组织的存活、增殖，并可能参与梗死区新生血管的形成，促进心肌组织修复。4、心肌梗死后梗死区iNOS表达规律的观察：梗死心肌内iNOS的表达在心肌梗死后随即增加，在心肌梗死后第3天达到高峰，随后逐渐减少。在心梗后不同时间点梗死区iNOS表达强度的变化规律为:3d＞1h＞7d＞10d＞14d （n=5，p<0.05）。5、iNOS 抑制剂对移植细胞存活和心功能影响的观察：治疗组于细胞移植前12h 给予选择性iNOS 抑制剂1400W 2mg/kg，腹腔注射，2次/天，维持3天，四周后行心功能、移植细胞存活率及组织学检测，对照组以等量生理盐水代替。Real-time PCR 检测显示1400W 治疗组和对照组Y 染色体sry基因序列的表达水平分别为4.2％、1.8％，结果表明，心肌梗死后第3天进行细胞移植并给予早期的iNOS 抑制剂干预，移植细胞存活率可有明显提高（n=10，P<0.01）。组织学检测发现，对照组BrdU 阳性细胞分布散乱，数量较少；治疗组中BrdU 阳性细胞数量明显增多，且分布较集中。相对应的HE 染色可见移植细胞的相似分布。然而，心功能检查在治疗组和对照组两组间无显著性差异（n=10，p>0.05）。实验结果说明iNOS 抑制剂的早期干预可以在一定程度上提高心梗后3d 移植组移植细胞的存活率，但对心功能却无改善作用。
　　 结论：1、心肌梗死后第7天进行MSCs 移植，在移植细胞存活率和心功能的改善上均优于心肌梗死后第3天进行细胞移植。2、iNOS的表达高峰出现在心肌梗死后第3天，随后逐渐下降。3、iNOS 抑制剂的早期干预在一定程度上提高了心梗后3d 移植组移植细胞的存活率，但不足以引起心功能的改变。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分骨髓间充质干细胞分离培养、鉴定及标记

第二部分心肌梗死模型的构建

第三部分BMSCs移植后存活情况及心功能观察

第四部分iNOS抑制剂干预对移植细胞存活及心功能的影响

综述骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的研究进展

致谢

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