低氧条件下三氧化二砷通过细胞周期阻滞及诱导凋亡抑制肺癌细胞增殖

摘要

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，也是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤。在世界大多数国家，肺癌的患病率和死亡率呈逐年上升的趋势，尤其是发达国家，肺癌在男性常见的恶性肿瘤中居首位。尽管目前对于肺癌的诊断和治疗方法较过去有了很大的提高，但中晚期肺癌患者的生存期仍无明显延长。对常见化疗药物耐药是导致晚期肺癌治疗失败的主要原因之一，而肿瘤局部组织低氧与肺癌细胞耐药性的增加具有显著的相关性。 局部组织低氧是实体肿瘤微环境的特征之一，低氧使肿瘤细胞低氧诱导因子1(HIF-1)的含量增加，进而通过诱导一系列低氧适应性基因的表达使肿瘤细胞在低氧环境中仍具有强大的增殖能力。此外，低氧还可通过诱导多耐药基因表达、降低细胞内药物蓄积等机制使肿瘤细胞对化疗药物耐药，导致许多传统化疗药在低氧环境中疗效下降。因此，发掘在低氧条件下对肿瘤细胞仍具有明显杀伤作用的化疗药物具有重要的治疗意义。 三氧化二砷(As2O3)是祖国医学的传统用药，上世纪被我国学者首次用于治疗早幼粒细胞白血病(APL)并取得较好疗效，得到世界公认。体外实验表明，As2O3对淋巴瘤、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤也有疗效，并且As2O3在低氧条件下对白血病、神经母细胞瘤等肿瘤细胞仍有较强的杀伤作用。进一步研究表明，As2O3对多种肿瘤细胞的细胞毒作用主要表现为诱导凋亡，其中阻滞细胞周期进展及调节细胞周期特异性调控蛋白的表达是其启动凋亡信号转导的主要作用机制之一。 基于以上研究现状，我们提出这样的问题：As2O3是否能够在低氧条件下抑制肺癌细胞的增殖?如果能够，是通过何种机制抑制肺癌细胞增殖的?与这些问题相关的研究国内外目前鲜有报道。本研究则对比观察了As2O3在低氧(1％O2)及常氧(21％O2)条件下对人肺腺癌A549及A549/R细胞(耐药细胞株，耐阿霉素、长春新碱等)的增殖及凋亡的影响，比较了As2O3与常规化疗药长春新碱(VCR)在低氧条件下对肺癌细胞的细胞毒作用的差异，并就As2O3在常氧及低氧条件下对肺癌细胞细胞周期进展及细胞周期特异性调控蛋白表达的影响等问题做了进一步研究。 第一部分常氧及低氧条件下As2O3均通过诱导凋亡抑制肺癌细胞的增殖 本部分实验以人肺腺癌A549及A549/R细胞为研究模型，观察不同浓度As2O3在常氧及低氧条件下对A549及A549/R细胞增殖及凋亡的影响，并探讨了低氧条件下VCR与As2O3对A549细胞毒性作用的差异。低氧条件由低氧发生袋获取。首先分别在低氧及常氧条件下用不同浓度As2O3或VCR作用于A549和(或)A549/R细胞48 h，收集处理后的细胞备用。其次，用MTT法检测各组细胞经As2O3或VCR处理后的细胞增殖抑制率(％)；对常氧及低氧条件下As2O3处理后的A549细胞进行HIF-1α的Western blot检测，以明确低氧条件的获取是否客观及As2O3对A549细胞HIF-1α蛋白表达的影响。最后，为了明确As2O3及VCR在常氧及低氧条件下对肺癌细胞凋亡的影响，我们用流式细胞仪Annexin V-PI双染色法检测不同浓度As2O3或VCR作用于A549和(或)A549/R细胞48 h后细胞的凋亡率(％)。 本部分实验结果显示：在A549细胞，当As2O3浓度大于5μmol/L时，细胞增殖抑制率在常氧和低氧条件下均呈剂量依赖性增加，细胞早期凋亡率及总凋亡率在常氧和低氧条件下也均呈剂量依赖性增加，晚期凋亡率及死亡率与对照组相比无明显改变；在A549/R细胞，当As2O3浓度大于5μmol/L时，细胞增殖抑制率、早期凋亡率及总凋亡率在常氧及低氧条件下均呈剂量依赖性增加，晚期凋亡率及死亡率与对照组相比无明显改变；在常氧及低氧条件下，As2O3对A549/R的细胞毒作用较A549细胞均无明显降低。在低氧条件下，As2O3对A549及A549/R.细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用较常氧条件均无明显降低，而长春新碱在低氧条件下对A549细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用较常氧条件下则明显减弱。Western blot实验显示常氧条件下细胞未表达HIF-1α蛋白，而低氧条件下细胞则大量表达HIF-1α[蛋白，但As2O3对细胞HIF-1α仅蛋白的表达无明显改变。 本部分实验表明：第一，As2O3在常氧及低氧条件下对A549细胞及耐药的A549/R细胞均具有显著的增殖抑制作用；第二，As2O3主要通过诱导凋亡抑制肺癌细胞的增殖，并且其细胞毒作用在低氧条件下无明显减弱(与常氧条件相比)，而VCR在低氧条件下对肺癌细胞的杀伤作用则明显减弱；第三，在本实验中细胞已充分适应低氧环境。 第二部分常氧及低氧条件下As2O3通过G2/M期阻滞及下调survivin表达诱导肺癌细胞凋亡 本部分实验的目的在于探讨As2O3诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的作用机制。分别在常氧及低氧条件下用不同浓度的As2O3作用于A549细胞48 h，收集各组细胞备用。流式细胞仪检测细胞周期的分布，半定量RT-PCR法检测细胞Cyclin B1、CDC2及survivin mRNA的表达，Western blot法检测细胞Cyclin B1、CDC2、phospho-CDC2(Thr-161)及survivin蛋白的水平。 本部分实验结果显示：在常氧及低氧条件下，As2O3均使A549细胞阻滞于G2/M期；As2O3均下调A549细胞Cyclin B1及survivin mRNA的表达，对CDC2mRNA的表达无显著影响；As2O3均下调549细胞Cyclin B1、phospho-CDC2(Thr-161)及survivin蛋白的水平，对总CDC2蛋白的水平无显著影响。根据这些结果我们认为，在常氧及低氧条件下As2O3可通过G2/M期阻滞、下调细胞周期特异性蛋白Cyclin B1/CDC2复合体表达及下调survivin基因表达诱导人肺腺癌A549细胞凋亡。 综上所述，我们的研究结果显示，As2o3对人肺腺癌A549细胞及耐药的A549/R细胞均具有显著的细胞毒作用，并且其细胞毒作用在低氧条件下无显著降低。阻滞细胞周期于G2/M期、下调Cyclin B1/CDC2复合体及survivin的表达可能是As2O3诱导A549细胞凋亡的机制。

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第一部分常氧及低氧条件下As2O3均通过诱导凋亡抑制肺癌细胞的增殖

第二部分常氧及低氧条件下As2O3通过G2／M期阻滞及下调survivin表达诱导肺癌细胞凋亡

小 结

参考文献

三氧化二砷抗肿瘤作用机制

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