A/B同型雄激素受体与前列腺癌关系的研究

摘要

前列腺癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。根据2009年的数据，前列腺癌已经成为欧洲和美国男性最大的杀手。前列腺是男性独有的性腺器官，也是一种雄激素依赖的器官，而雄激素是通过其受体发挥作用的，雄激素受体(AR)则是雄激素代谢和发挥作用过程中的中心环节之一。因此，雄激素受体在前列腺癌的发生发展中占有重要地位。
　　 受孕激素受体(PR)亚型和雌激素受体(ER)亚型的启发，1993年Carol在人的生殖器皮肤成纤维细胞中首次证实雄激素受体A、B两种同型受体的存在，分别是AR-B和AR-A。其中AR-B是完整、全长的雄激素受体，分子量为110 kDa，它是正常成人大多数组织中最常见雄激素受体亚型，所占比例高达80％～95％。而AR-A缺乏完整氨基端结构，比AR-B少N端起始部位的188个氨基酸，它但其DNA结合区和激素结合区结构完整，分子量为87 kDa，在正常成人大多数组织中表达水平较低，所占比例低于20％。目前尚无克隆AR-A mRNA的报道。雄激素存在A、B两种同型受体这种情况与孕激素受体(PR)极为相似：二者同为单一基因，转录一条mRNA，同样存在完全转录和部分转录的A、B两种同型受体。研究表明：子宫内膜癌和乳腺癌的发病与孕激素A、B两种同型受体存在着密切相关性，孕激素A、B受体的分布、表达和丢失与乳腺癌、卵巢肿瘤的内分泌疗效亦存在密切相关。也有研究表明，孕激素A、B两种同型受体的生物学功能不同。
　　 与孕激素同型受体的研究相比，有关雄激素A、B同型受体的研究目前还只是方兴未艾。Catalano在对结肠癌中AR的研究发现，在正常结肠粘膜中AR-A和AR-B均有表达，但在结肠癌组织中AR-B表达缺失，提示两者在肿瘤的形成发展过程中可能发挥不同的作用。Liegibel等研究发现AR-A和AR-B两者的功能不同。
　　 目的:
　　 研究A/B同型雄激素受体在不同前列腺组织中的表达，明确前列腺癌组织中A/B同型雄激素受体表达的变化，并研究探讨A/B同型雄激素受体在前列腺癌中的功能，明确A/B同型雄激素受体表达变化及功能差异在前列腺癌发生、发展中的作用。
　　 方法：
　　 本研究旨在通过应用Western blot、免疫荧光技术，研究分析50例前列腺癌、15例前列腺增生和15例正常前列腺组织中A/B同型雄激素受体蛋白的表达情况，从蛋白表达水平研究原发性前列腺癌组织中A/B同型雄激素受体蛋白表达水平的改变。同时应用realtime-PCR技术研究不同前列腺组织中雄激素受体mRNA表达的变化。通过质粒制作、质粒转染等技术初步研究前列腺癌细胞中A/B同型雄激素受体蛋白的功能差异，观察二者对前列腺癌PC3细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力的影响。
　　 结果:
　　 Western Blot结果显示：各个前列腺癌、前列腺增生以及正常前列腺组织均表达AR-A与AR-B两种同型雄激素受体。其中全长的AR-B雄激素受体是优势表达受体，占总数的95～80％，AR-A型雄激素受体表达量较低，占总数的5～20％，与文献报道相符。正常前列腺组织和前列腺增生组织中AR-A(P=0.703)和AR-B(P=0.505)表达量及AR-A/AR-B比值(P=0.871)差异无统计学意义。前列腺癌组织中AR-A、AR-B雄激素受体表达量及AR-A/AR-B比值较正常前列腺中表达量本别增高2.8倍、1.47倍和1.92倍，差异有统计学意义(P＜0.01)。较前列腺增生组织组织中AR-A、AR-B及AR-A/AR-B比值较正常前列腺中表达量本别增高2.38倍、1.37倍和1.75倍，差异有统计学意义(P＜0.01)。AR-A和AR-B的表达与前列腺癌患者的年龄无关(p＞0.05)，但与前列腺癌Gleason评分有关。Gleason评分＞7的前列腺癌患者组织中AR-A的表达量较Gleason评分≤7的前列腺癌患者组织中增高1.25倍，同时AR-B增高1.15倍。差异有统计学意义(P＜0.05)。而Gleason评分＜7的前列腺癌组织中，AR-A和AR-B的表达量及二者比例较正常前列腺组织和前列腺增生组织增高(P＜0.05)。临床分期＞T2期的前列腺癌患者组织中，AR-A和AR-B的表达量及二者比例较临床分期≤T2期的前列腺癌患者组织高，但差异无统计学意义，可能与临床分期＞T2期的前列腺癌患者数量较少有关。为在组织中进一步确证A/B同型雄激素受体蛋白的表达，我们使用双重免疫荧光组织化学结果显示：前列腺癌组织中AR-B和AR-A+B雄激素受体表达量较正常前列腺2.53倍和2.10倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。前列腺癌组织中AR-B和AR-A+B雄激素受体表达量较前列腺增生组织中表达量增高2.31倍和1.93倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。Gleason评分＞7的前列腺癌患者组织中AR-B的表达量较Gleason评分≤7的前列腺癌患者组织中增高1.25倍，同时AR-A+B增高1.15倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。A/B同型雄激素受体蛋白的表达临床分期无关，可能与临床分期＞T2期的前列腺癌患者数量较少有关。此结果与Western Blot结果相符。我们使用Realtime-PCR技术检测了前列腺癌，前列腺增生和正常前列腺标本中AR mRNA的表达水平，结果显示正常前列腺组织和前列腺增生组织中AR mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)。前列腺癌组织中AR mRNA表达增高10.65倍(P=0.019)和11.93倍(P=0.019)。前列腺癌组织中，Gleason评分＞7的前列腺癌患者组织中AR mRNA的相对表达量增高，较Gleason评分≤7的前列腺癌患者组织中AR mRNA的表达量增高5.02倍。差异有统计学意义(P＜0.05)。分期＞T2的前列腺癌患者组织中AR mRNA的相对表达量增高，较分期≤T2的前列腺癌患者组织中AR mRNA的表达量增高1.45倍，差异无统计学意义，考虑与分期＞T2的前列腺癌组织仅仅4例，数量较少有关。
　　 在胞浆蛋白与胞核蛋白分别电泳的结果中，我们发现AR-A雄激素受体蛋白仅在胞浆蛋白中表达，胞核蛋白中不表达AR-A雄激素受体蛋白，而AR-B雄激素受体蛋白在胞浆蛋白和胞核蛋白中都有表达。进一步研究结果显示：LNCaP细胞雄激素饥饿培养5天后，加入睾酮刺激2小时，AR-A雄激素受体蛋白可以在睾酮刺激下由细胞浆转运进入LNCaP细胞核内。在进行免疫共沉淀后行Western Blot检测的结果显示：A/B同型雄激素受体二者不可形成异二聚体。此结果与AR-A/B在亚细胞结构分布不同相印证：如果AR-A与AR-B能形成异二聚体，则二者不可能在亚细胞结构分布上如此不同。
　　 为进一步研究AR-A在前列腺癌细胞中的生物学活性，我们使用pEGFP-AR质粒通过突变后，制作出仅表达AR-A的新质粒pEGFP-AR-A。通过质粒转染技术将AR-A转染进入不表达雄激素受体的前列腺癌细胞系PC3细胞，获得仅仅表达AR-A的前列腺癌细胞PC3-AR-A。通过增殖实验我们发现，AR-A可以抑制前列腺癌细胞PC3细胞的增殖，抑制率在第3天以后维持在61％左右，而AR-B的抑制率仅维持在10％-20％。侵袭实验和增殖实验结果显示，AR-A和AR-B都可以抑制前列腺癌细胞的侵袭能力和增殖能力，AR-A转染的PC3细胞的迁移、侵袭能力较PC3组降低20.6％和29.3％。AR转染的PC3细胞侵袭、迁移能力最低，较PC3组降低39.4％和44.4％。
　　 结论:
　　 A/B同型雄激素受体在原发性前列腺癌的组织中表达量增高，且A/B二者比例增高。A/B同型雄激素受体蛋白的表达量和表达比例与病理分级及临床分期有关。侵袭实验结果显示，AR-A可以降低前列腺癌细胞的侵袭能力和增殖能力。前列腺癌组织中的A/B同型雄激素受体表达增高可能与前列腺癌发生发展有关，且AR-A表达绝对量和比例增高可能是晚期、低分化前列腺癌进展的自我保护现象。使用特异性AR-A受体激动剂，增强前列腺癌中的AR-A的活性从而抑制前列腺癌细胞增殖，并降低前列腺癌细胞的侵袭能力和增殖能力，可能成为治疗前列腺癌的一种有效方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分：A/B同型雄激素受体在不同前列腺组织中的表达

第二部分双重免疫荧火组织化学技术检测前列腺组织中A/B同型雄激素受体蛋白的表达

第三部分 A/B同型雄激素受体在前列腺癌PC-3细胞迁移、侵袭的能力

第四部分：雄激素受体mRNA在不同前列腺组织中的表达

全文结论

文献综述：核受体家庭成员PR、ER和AR亚型研究进展

致谢