腺病毒介导的mda-7/IL-24基因对人喉癌细胞Hep-2的凋亡作用

摘要

[目的]
　　 1.构建重组腺病毒搭载的基因mda-7(melanoma differentiation-associated gene-7，黑色素瘤分化相关基因-7)/IL-24(Interleukin-24,白介素24)。
　　 2.使用构建好的载体系统Ad-mda-7/IL-24感染人喉癌Hep-2细胞系后通过定性、定量方法观察对喉癌细胞生长的影响。
　　 [方法]
　　 1.鉴定pPEP4质粒上的mda-7/IL-24，KpnI和XhoI限制性核酸内切酶消化腺病毒穿梭质粒载体pAdtrackCMV(含绿色荧光蛋白GFP)，连接后转化感受态E.coli DH5α，卡那霉素筛选克隆，抽提质粒，酶切、PCR鉴定；PmeI单酶切线性化搭载mda-7/IL-24基因的穿梭质粒pAdTrackCMV-mda7，与腺病毒骨架质粒AdEasy-1一起电转化至重组专用感受态细胞BJ5183，两质粒同源重组，卡那霉素+链霉素双抗筛选克隆，质粒抽提、电泳，PacI单酶切鉴定重组克隆，将阳性克隆质粒再转化入E.coli DH5α感受态，卡那霉素筛选克隆，再次抽提质粒，电泳、酶切、PCR鉴定获得pAd-mda7和pAd-GFP；限制性核酸内切酶PacI单切pAd-mda7和pAd-GFP，切胶回收、质粒定量后转染人胚肾293T细胞行病毒扩增，收集病毒并行滴度测定备用。
　　 2.Hoechst33258染色—定性检测：将喉癌Hep-2细胞接种于6孔板，一孔计数，三孔分别加入等量一定感染复数(MOI)的Ad-mda-7(Ad组)，Ad-GFP(Ead组)以及PBS缓冲溶液(Control组)。感染48h后，将细胞固定Hoechst33258染色，反复洗涤后倒置荧光显微镜下观察细胞数量、细胞形态以及细胞颜色分布和亮度。
　　 3.PI染色后流式细胞仪分析—定量检测：选择合适感染复数(MOI)感染6孔板定量接种的Hep-2细胞，48h后收集细胞后离心、PBS缓冲液稀释，加入万分之三的TritonX-100细胞膜打孔，加入工作浓度PI(碘化丙啶)避光染色后，流式细胞仪计数检测，测定细胞周期变化。
　　 [结果]
　　 1.利用复制缺陷型腺病毒载体成功构建Ad-mda-7/IL-24以及Ad-GFP。
　　 2.光学显微镜下观察：24h后Ad-mda7组和Ad-GFP组Hep-2细胞开始部分脱离，且Ad-mda7组较Ad-GFP组脱离更多，细胞总数更少。PBS处理组正常生长，只有少量细胞脱离；48h后Ad-mda7组生长状态明显影响，状态差，贴壁细胞明显减少，而Ad-GFP组细胞生长状态受到一些影响，一部分细胞也脱离培养孔生长，相比前者，细胞数量更多(包括仍贴壁细胞和细胞总数量)，生长状态更好。PBS组细胞已经基本长满培养孔，有少量细胞自然脱离生长。72h后细胞生长状态明显变差，Ad-GFP组与Ad-mda7组均大量脱离，PBS处理组也有很多细胞脱离。
　　 3.荧光显微镜下观察Hoechst33258凋亡染色结果：Ad-mda7处理组细胞固缩，细胞核致密浓染，颜色发白；Ad-GFP处理组细胞也有一些收缩和20％左右的细胞脱离，但无凋亡染色特征；PBS处理组细胞形态饱满，生长正常。
　　 4.PI染色流式细胞仪检测结果：以MOI=30感染48h后Control组SubG1期比例5.84％；Ead组SubG1期比例为14.53％；Ad-mda7处理，SubG1期比例为21.65％，凋亡细胞所占比例递增；MOI=50，G2M Block检测结果：Ad-mda7组G2/M Block期比例为40.60％，Ad-GFP组G2/M Block期比例为7.93％，PBS组相应G2/M Block期比例为2.24％。
　　 [结论]
　　 1.重组人5腺病毒系统(由穿梭质粒pAdTrackCMV，腺病毒骨架质粒AdEasy1，以及重组优化大肠杆菌BJ5183组成)中，穿梭质粒pAdTrackCMV上构建有绿色荧光蛋白(GFP)以及多克隆区域，可以用来搭载mda-7/IL-24。骨架质粒AdEasy1缺失了腺病毒基因组的E1区和E3区，使得所生产的腺病毒不能在911和293以外的细胞中自我扩增，保证了实验的剂量可控性和以及生物安全性，但是又保留了病毒高效的感染能力以及搭载基因的蛋白表达能力。
　　 2.Ad-mda-7/IL-24转染喉癌hep-2细胞后48h检测各项指标较理想，72h细胞生长状态明显变差，各实验组细胞大量脱离，不适合用于进一步细胞处理和检测。
　　 3.腺病毒搭载的mda-7/IL-24对喉癌hep-2细胞生长有抑制和促凋亡作用，且对喉癌细胞生长的阻滞作用可能与感染复数正相关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照简表

声明

前言

材料与方法

一、材料

二、方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 mda-7/IL-24抗肿瘤特性的研究进展

论文发表情况以及科研情况说明

致谢

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