蛋白质组学技术在结直肠癌、食管癌筛查、诊断中的应用

摘要

研究背景与目的:
　　 恶性肿瘤对人类健康的危害毋庸置疑。在我国，随着人口老龄化趋势的加重，恶性肿瘤的发病率总体呈上升趋势，其中列前几位的分别为：胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、子宫癌、结直肠癌及乳腺癌等。由于人民生活水平的提高、生活方式的改变、社会压力带来的心理变化，结直肠癌的发病率逐年增加；我国是食管癌的高发区，死亡率在恶性肿瘤中位居前列。同时，由于我国人口多、经济发展水平不均衡导致健康教育不均衡，因此，恶性肿瘤的二级预防，即早发现、早诊断、早治疗仍是恶性肿瘤诊治的努力方向。目前常用的食道及结直肠癌的诊断方法主要有：1、影像学检查，如X线胃肠道钡餐造影、CT、MRI、EUS(食管内窥镜超声检查)、TRUS(经直肠超声检查)等；2、内镜检查，如纤维胃镜、纤维肠镜等；3、血清学检查，各种肿瘤标志物的检测；4、其他检查，如基因学检查。以上各种方法均不同程度地存在病人依从性差、检测灵敏度和特异度不高等问题。本研究应用表面增强激光解析/离子化飞行时间质谱仪(surface-enhanced laserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)及同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)蛋白质组学技术，建立结直肠癌诊断和筛查、食管癌诊断的分类树模型，找到更可靠、更直接的肿瘤标志蛋白，探索更为便捷有效的结直肠癌及食管癌的筛查、诊断方法。
　　 方法:
　　 1、研究对象
　　 1.1血清样本
　　 建模组：结直肠癌35例，结直肠腺14例，结直肠炎性疾病12例，食管癌26例以及正常人44例。
　　 测试组：结直肠癌30例，结直肠腺瘤10例，结直肠炎性疾病10例，食管癌10例以及正常人30例。
　　 1.2组织样本结直肠癌组织及相应正常结直肠粘膜组织4例，食管癌组织及相应正常食管上皮组织4例。
　　 2、建立分类树模型应用SELDI-TOF-MS技术结合铜离子蛋白芯片获得35例结直肠癌、14例结直肠腺瘤、12例结直肠炎性疾病、26例食管癌和44例正常人的血清蛋白质谱图。分别应用Biomarker Wizard及Biomarker Pattern软件分析35例结直肠癌与44例正常人血清样本，得到结直肠癌诊断分类树模型；分析14例结直肠腺瘤、12例结直肠炎性疾病(结直肠炎性病)及44例正常人血清样本得到结直肠癌筛查分类树模型；分析26例食管癌、44例正常人血清样本得到食管癌诊断分类树模型。
　　 3、双盲验证分类树模型随机抽取正常人和结直肠癌患者各30例盲法验证结直肠癌诊断分类树模型；正常人30例、结直肠腺瘤10例及结直肠炎性疾病10例盲法验证结直肠癌筛查分类树模型；正常人30例、食管癌10例盲法验证食管癌诊断分类树模型。
　　 4、组织差异蛋白的挖掘应用iTRAQ结合其他蛋白质组学技术比较结直肠癌肿瘤及正常组织、食管癌肿瘤及正常组织得到组织差异蛋白。
　　 5、组织差异蛋白及血清差异蛋白的比较比较组织差异蛋白及相应的血清差异蛋白，挖掘其可能存在的关联。
　　 结果:
　　 1、建立并盲法验证结直肠癌诊断、筛查分类树模型，比较肿瘤组织差异蛋白质并分析其与相应血清差异蛋白质的相关性
　　 通过对结直肠癌35例、正常人44例血清样本的检测分析，建立了结直肠癌诊断模型。该模型在测试模式下，诊断准确率为87.34％，灵敏度、特异度和阳性预测值分别是90.91％、82.86％及87.88％，双盲验证其诊断总准确率为80％，灵敏度为83.33％，特异度为76.67％，阳性预测值为78.13％，Kappa值0.5775。通过对结直肠腺瘤14例、结直肠炎性疾病12例及正常人44例血清标本的检测分析，建立了结直肠腺瘤筛查分类树模型。在测试模式下，该模型的诊断准确率91.43％，灵敏度71.43％，总特异度96.43％，阳性预测值92.86％，双盲验证其总准确率为84.62％，灵敏度为60％，特异度为100％。Kappa值0.7059。
　　 比较4例结直肠癌组织与相应正常结直肠粘膜组织，共发现802个差异蛋白质，其中有87个蛋白的表达差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 上述87个组织差异表达蛋白质与血清中发现的结直肠癌与正常人的差异蛋白质无明显相关性。
　　 2、建立食管癌诊断分类树模型，比较肿瘤组织与正常组织差异蛋白质并分析其与相应血清差异蛋白质的相关性
　　 通过对26例食管癌及44例正常人血清样本检测分析，建立了食管癌诊断模型。在测试模式下对上述人群进行分组，准确率为75.71％，灵敏度及特异度分别为92.31％、65.91％，阳性预测值61.53％，双盲验证其总准确率为72.5％，灵敏度为70％，特异度为73.33％，阳性预测值为46.67％。Kappa值0.3476。
　　 比较4例食管癌组织与相应正常食管上皮，共发现802个蛋白质，其中有49个蛋白的表达差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 上述49个组织差异表达蛋白质与血清中发现的食管癌与正常人的差异蛋白质无明显相关性。
　　 结论:
　　 结直肠癌与食管癌在发生发展过程中产生多种特异性蛋白，应用蛋白质组学技术可检测到这些特异性蛋白，它们有可能成为新的更为有效的肿瘤标志物。同时，这些特异的蛋白质对揭示结直肠癌及食管癌的发生机制也将起到重要的作用。蛋白质组学技术在挖掘潜在肿瘤标志物方面有广阔而光明的应用前景，对恶性肿瘤的筛查和诊断有重要的应用价值，对恶性肿瘤的二级预防有积极的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

前言

第一部分主要仪器设备、试剂配制及软件分析

第二部分 蛋白质组学技术在结直肠癌及食管癌的诊断、筛查中的应用

实验一蛋白芯片在大肠癌诊断、筛查中的应用

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

实验二蛋白芯片在食管癌诊断中的应用

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

实验三 iTRAQ技术在结直肠癌、食管癌中的应用及其组织与血清差异蛋白质比较

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

综述 蛋白质组学技术在肿瘤标志物研究中的应用

在读期间论文撰写情况

致谢