Eotaxin在皮肤过敏性疾病中的表达调控及苦参方提取物与eotaxin siRNA的经皮治疗研究

摘要

皮肤过敏性疾病是高发的变态反应型疾病，是当皮肤暴露于外界过敏原时，由全身免疫系统参与而症状产生于局部的病理过程。除了在普通人群中常见外，对于在边防、海岛等恶劣环境下进行工作与生活的部队官兵，特别如遇战事、灾害等严峻情况，影响尤为严重。因此，深入探讨皮肤变态反应性疾病的病理过程与机制，发现新的药物作用靶点和新的治疗药物，具有重要的科学价值与军事意义。
　　 变态反应型疾病发病的确切机制目前仍不十分清楚，但炎症细胞的募集是最终导致过敏性炎症发生和发展原因。嗜酸粒细胞(eosinophils，Eos)是过敏性疾病中重要的效应细胞，其浸润于过敏部位，释放毒性蛋白，造成组织损伤，导致炎症发生。造成Eos局部浸润的最重要的趋化因子是嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin/CCL11)，因此eotaxin的表达与调控是过敏性疾病的重要环节和药物治疗靶点。
　　 Eotaxin参与了皮肤过敏性疾病(如特异性皮炎、接触性皮炎、药物过敏性皮肤疾病等)的进程已得到证实。而人体皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，eotaxin在过敏皮肤中的确切表达部位及表达的动态过程目前还没有证实。本研究中，我们以小鼠接触性皮炎(ACD)模型为基础，探讨了eotaxin在过敏环境下皮肤中的表达部位及动态特征。同时对皮肤过敏反应的免疫学特征进行了观察，我们对CD4+和CD8+T淋巴细胞的浸润的程度和时程进行了比较。此外，为了阐明eotaxin表达的调控机制，我们以构成表皮层的角质形成细胞(KC)株HaCaT细胞和构成真皮层的真皮成纤维细胞(FBs)为基础，使用TNF-α和IL-4刺激两种细胞，观察eotaxin分泌量的改变，并检测与两种因子相关的转录因子NF-κB和STAT6的激活情况，探讨eotaxin表达的转录机制。
　　 皮肤过敏性疾病的治疗是本课题关注的重要内容。相对于化学药物治疗，传统药物更显示出开发成本低、疗效好、副作用少、重视免疫平衡等优点。苦参方为一治疗过敏性皮肤病的传统中医药方剂，其提取物的主要成份为苦参碱(Mat)、氧化苦参碱(Omt)、槐果碱(Sop)、氧化槐果碱(Osp)以及荆芥挥发油(SVO)。我们考察了苦参方提取物(KS)凝胶剂对小鼠接触性皮炎的治疗效果，同时检测其对eotaxin的抑制作用，并于细胞水平对其提取物抑制TNF-α和IL-4诱导的eotaxin表达的信号转导机制进行进一步阐述。
　　 基因治疗是目前疾病治疗的一个研究热点，我们尝试性地对皮肤过敏性疾病的经皮基因治疗进行了探索。微乳是经皮给药的一个良好剂型，将经稳定性修饰的eotaxin特异性siRNA制成W/O型微乳剂型，经皮给药，观察其对小鼠接触性皮炎治疗效果及对eotaxin的在皮肤组织中表达的抑制作用。
　　 第一部分：Eotaxin在皮肤过敏性疾病中的表达调控
　　 (一)Eotaxin在小鼠接触性皮炎(ACD)中的表达规律研究。
　　 (二)Eotaxin在皮肤细胞中产生的调控机制研究。
　　 第二部分：苦参方提取物小鼠接触性皮炎的治疗作用及对eotaxin抑制作用研究
　　 (一)苦参方提取物(KS)治疗小鼠ACD的疗效及机制研究。
　　 (二)KS抑制皮肤细胞中eotaxin表达机制研究。
　　 第三部分：Eotaxin特异siRNA微乳治疗小鼠接触性皮炎初步研究
　　 通过本课题的研究，进一步证实了eotaxin在过敏性皮肤疾病病理过程中的重要意义，揭示了eotaxin在过敏性皮肤疾病中的表达规律及调控机制。证明了中药方剂苦参方治疗过敏性皮肤疾病的治疗效果和作用机制。初步探讨了以RNAi为基础的治疗皮肤疾病的新的基因治疗方式。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一部分 Eotaxin在皮肤过敏性疾病中的表达调控

一、实验材料

(一)动物和细胞

(二)主要材料、试剂及配制

(三)主要仪器设备

二、实验方法

(一)小鼠ACD模型的建立及样本采集

(二)细胞培养

(三)分子生物学、组织、细胞学检测

(四)统计分析

三、结果

(一)Eotaxin在小鼠接触性皮炎(ACD)中的表达规律研究

(二)Eotaxin在皮肤细胞中产生的调控机制研究

四、讨论

小 结

第二部分 苦参方提取物对小鼠接触性皮炎的治疗作用及对eotaxin的抑制作用研究

一、实验材料

(一)动物和细胞

(二)主要材料、试剂、药品及配制

(三)主要仪器设备

二、实验方法

(一)小鼠ACD模型建立及实验分组

(二)细胞培养与实验分组

(三)分子生物学、组织、细胞学检测

(四)MTT法检测不同药物对细胞生存率的影响

(五)统计分析

三、结果

(一)苦参方提取物(KS)治疗小鼠ACD的疗效与机制研究

(二)KS抑制皮肤细胞中eotaxin表达机制的研究

四、讨论

小结

第三部分：Eotaxin特异siRNA微乳治疗小鼠接触性皮炎初步研究

一、实验材料

(一)动物和细胞

(二)主要材料、试剂及配制

(三)主要仪器设备

二、实验方法

(一)细胞培养

(二)Eotaxin特异siRNA设计、合成、修饰及筛选

(三)siRNA微乳制备

(四)细胞生存性实验

(五)小鼠ACD模型的建立及给药

(六)分子生物学、组织、细胞学检测

(七)统计分析

三、结果

(一)细胞培养

(二)Eotaxin specific siRNA筛选

(三)siRNA微乳的质量稳定性及透皮效果考察

(四)Eotaxin siRNA微乳(ESM)对小鼠ACD的治疗作用及对皮肤eotaxin表达的影响

四、讨论

小 结

结 论

综述 IgE介导的小鼠皮肤三相过敏反应模型的研究进展

参考文献

附录 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢