雌激素联合顺铂治疗人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤组织中Survivin mRNA的检测及意义

摘要

目的：探求凋亡抑制因子Survivin mRNA在雌激素联合顺铂治疗人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤组织中的表达情况，分析雌激素联合顺铂治疗卵巢癌裸鼠移植瘤后Survivin的表达及其与细胞凋亡、血管生成的相关性，探讨雌激素在卵巢癌患者及术后应用的可行性。
　　 方法：⑴于液氮中取出卵巢癌细胞株HO-8910，传统方法复苏后，接种于RPMI-1640培养液(含10％去雌激素的胎牛血清)中，在细胞培养箱(条件为37℃、5％二氧化碳饱和湿度)中培养。仔细观察卵巢癌细胞的生长情况，当细胞生长至对数生长期时消化传代，一般约为3天左右。⑵30只4周龄，体重约14～16克的雌性BALB/c裸鼠，适应性喂养于泰山医学院SPF级别实验动物中心。取处于对数生长期的单层癌细胞，经酶消化处理后，配成浓度为1×107ml的单细胞悬液，消毒后于裸鼠背侧近后肢处皮下注射接种，每只0.2ml。⑶癌细胞接种后，当瘤子长至大小似粟粒时，用剪耳做标记的方法随机的将裸鼠分为不同用药的6组，每一组有裸鼠5只。药物浓度及具体分组如下：A组(对照组)：0.2ml生理盐水；B组(低剂量17β-E2组)：0.2ml剂量为1.3μg/d17β-E2；C组(高剂量17β-E2组)：0.2ml剂量为3.9μg/d17β-E2；D组(顺铂组)：0.2ml浓度为5mg/kg的顺铂；E组(顺铂+17β-E2)：0.2ml浓度为5mg/kg的顺铂+1.3μg/d17β-E2；F组(顺铂+17β-E2组)：0.2ml浓度为5mg/kg的顺铂+3.9μg/d17β-E2。⑷脱臼法处死裸鼠后，完整取出瘤体，采用实时荧光定量RT-PCR技术检测17β-E2单独使用或者联合顺铂用于卵巢癌细胞裸鼠移植瘤组织中Survivin mRNA的表达。⑸利用流式细胞术检测人卵巢癌裸鼠移植瘤组织的细胞凋亡及细胞周期的情况。⑹免疫组化SP法检测各实验组裸鼠皮下移植瘤中VEGF、CD34的表达。
　　 结果：①A组、B组、C组、D组、E组、F组裸鼠移植瘤组织中Survivin mRNA的表达相对量分别是1.000、0.429±0.014、0.210±0.018、0.090±0.007、0.045±0.004、0.021±0.001，各实验用药组与对照组相比，P<0.05，差异有统计学意义。17β-E2+顺铂联合用药组和单独顺铂用药组相比，裸鼠移植瘤组织中Survivin mRNA的表达均降低，P<0.05，差异有统计学意义。②细胞周期：各治疗组细胞周期G0/G1期细胞逐渐减少，S期细胞明显增多，说明可能将细胞主要阻滞于S期。③凋亡情况：各用药组凋亡率较对照组凋亡率均升高，低剂量17β-E2与生理盐水组凋亡率相比，p>0.05，差异没有统计学意义，说明生理盐水组、低剂量17β-E2的凋亡率没有显著差别。C组、D组、E组、F组与A组比较，p<0.05，差异有统计学意义，各用药组细胞凋亡中以晚期凋亡居多。④免疫组织化学法检测VEGF蛋白含量，CD34计数，对于每个指标免疫组织化学评分，各处理组和对照组相比，E组、F组和单用药组相比，p<0.05，差异均有统计学意义。⑤人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤组织中Survivin mRNA的表达与细胞凋亡、VEGF及MVD的关系，经Spearman等级相关分析，提示Survivin mRNA的表达与细胞凋亡、VEGF、MVD均呈高度正相关。
　　 结论：⑴实时荧光定量RT-PCR技术可以敏感且特异性地检测出凋亡抑制因子Survi-vin mRNA在人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤组织中的表达，且方法准确可靠，操作方便。⑵17β-E2单用或联合顺铂应用于裸鼠，能降低各实验组裸鼠移植瘤组织中Survivin mRNA的表达。⑶17β-E2能提高顺铂的疗效，两药起到协同作用，可能与Survivin在细胞凋亡、血管生成中的重要作用有关。⑷通过动物实验研究说明，雌激素在卵巢癌患者术后应用及改善术后患者生活质量中具有可行性。