微泡增强的超声空化阻断肝脏和肝肿瘤微循环的实验研究

摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，其治疗一直是医学界的难点和热点。实体瘤的发生、生长、转移依赖肿瘤新生血管生成。肿瘤新生血管因受多种血管生长因子的刺激，生长迅速，结构原始，具有管壁薄弱、基底膜不完整、通透性高、缺乏弹力纤维层等先天性发育缺陷，因此，针对肿瘤新生血管的抗肿瘤血管生成治疗是继化疗和放疗之后一种新的治疗模式，然而，目前已发现的抗肿瘤血管生成方法，几乎都是采用化学或者生物药物攻击肿瘤新生血管的特异性生物学靶点，有一定副作用，治疗效果并不理想。针对肿瘤新生血管的物理治疗方法未见报道。
　　 近年来，微泡超声造影剂在基因转染、药物靶向释放、溶栓等方面的治疗用途越来越受到业界的关注。超声空化效应(cavitation，注：空化效应是指液体中微气泡在超声作用下产生震荡、膨胀、收缩以及内爆等一系列动力学过程，伴随瞬态高温、高压、冲击波、放电和微射流等多种能量释放行为)是热效应之外另一种超声的主要物理效应。微泡超声造影剂(简称微泡)作为一种有效地空化核，在适当超声脉冲激发情况下，可以发生显著的空化效应，空化释放的机械能(非热效应)具有靶向定位消融组织的潜在能力，这使得破坏病理结构薄弱的肿瘤新生血管成为可能。
　　 本课题在前期执行微泡超声空化阻断肿瘤血管的研究中发现，在经静脉注射脂质微泡超声造影剂联合脉冲式超声照射的情况下，超声空化损伤效应可以被较稳定的控制发生，可以造成正常肠系膜小血管管壁空化机械损伤，出血、血肿和血栓形成。
　　 目的：
　　 通过经静脉注射微泡可以显著降低血液超声空化阈值、增强空化损伤效应。本研究建立在微泡联合脉冲式超声阻断肠系膜微血管实验的基础上，希望通过微泡超声空化物理破坏、并阻断兔VX2肝肿瘤新生血管，造成肿瘤微循环阻断、缺血坏死和生长抑制，从而探索一种新的、针对肿瘤新生血管的非创伤性物理治疗方法。
　　 方法：
　　 (一)主要仪器及试剂：
　　 1.实验仪器：课题组自行研制的小型脉冲式聚焦超声空化治疗仪治疗头频率1.2 MHz，发射占空比0.5％，峰值负压为4.6 MPa，平均声强(ISPTA)0.89W/cm2。美国通用电器公司Logic9彩色多普勒超声仪，配有超声造影模式。
　　 2.实验试剂：“脂氟显”脂质微泡第三军医大学新桥医院自行研制，乳白色凝乳状微泡悬浮液，核心气体为全氟丙烷，微泡浓度约为7×109/ml，98％粒径小于8μm，平均2μm。
　　 (二)微泡增强的超声空化阻断正常肝血流灌注的初步研究
　　 1.实验分组：将健康新西兰大白兔33只分为三组，即超声微泡组(MB+US组)、单纯超声治疗组(US组)、假照组(SHAM组)，超声微泡组采用超声照射联合经静脉微泡注射；单纯超声组仅有超声照射；假照组仅施予超声治疗头假照。其中，每组经腹壁照射8只用于造影血流灌注评价，开腹辐照3只用于病理机制分析。
　　 2.实验时间点：各组治疗前后超声造影，分析各时间点为pre(造影前)、0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、24h(共7个时间点)，记录其超声造影灌注峰值灰阶变化，对灌注高峰影像进行视觉评分，分析微泡增强的超声空化阻断兔正常肝实质血流的持续时间和恢复情况。
　　 3.超声空化程序：实验兔麻醉后建立耳缘静脉通道。造影团注“脂氟显，，微泡0.01 ml/kg进行超声造影影像观察(其中单纯超声治疗组及假照组治疗前一天造影并存图)；确定肝脏位置后，按设定时间和方向治疗超声辐照肝脏。超声微泡组在治疗时，经静脉缓慢推注微泡(0.1 ml/kg，以生理盐水稀释至5 ml)同时用超声治疗探头经腹壁辐照肝脏5min；单纯超声治疗组用5 ml生理盐水代替微泡，同时用超声治疗探头垂直经腹辐照5min；假照组用治疗头假照5min，用相同剂量的生理盐水替代微泡。开腹辐照(用于机制研究)采用剑下正中线切口，经手术暴露肝脏后轻轻将肝左中叶牵出腹腔用于治疗。各组超声空化治疗程序同上完成后立即获取照射靶区标本用于病理检查。
　　 4.分析法
　　 (1)视频密度分析法：记录各组在治疗前后各时间点，靶区超声造影动态影像。以JPG格式输出各感兴趣点的数字化图像；然后采用Adobe Photoshop CS3软件中的直方图功能对其进行灰阶定量分析，取样注意避开大中血管断面，软件自动计算出取样框内的平均灰阶值。
　　 (2)视觉评分分析法：肝超声造影血流灌注分析，记录各组在治疗前后各时间点，靶区肝脏超声造影动态影像。局部肝组织血流灌注视觉评分方法分为0-3级，运用双盲法对各时间点造影灌注峰值灰阶变化进行评分。
　　 (三)微泡增强的超声空化阻断VX2肿瘤微血管实验
　　 1.实验分组及时间点：采用24只VX2肿瘤荷瘤兔，实验分组同前，各组肿瘤重复治疗时间点为：0h(开始治疗时间)、48h、96h(共3个时间点观察)。各组观察时间分别为：pre(治疗前)、post(治疗后)、30min、24h、48h、96h、10d(共7个时间点)。观察分析各时间点肿瘤造影灌注峰值灰阶变化(pre、post、30min、24h)。测量肿瘤体积，实验完成后肿瘤标本进行凋亡检测。
　　 2.分析法：采用视频密度法(同4(1))分析肿瘤超声造影灌注高峰灰阶值的变化；按椭球体公式计算肿瘤体积，描绘各组治疗后肿瘤生长曲线；病理学检查肿瘤坏死情况；TUNEL法检测各组细胞凋亡指数。
　　 结果：
　　 1.微泡增强的超声空化阻断正常肝血流灌注的初步研究
　　 (1)视频密度：治疗前每组各时间点的平均灰度值，ROI区域的对比平均灰度值范围是88.4-89.1，三组无显著统计学差异。在治疗后0min，MB+US组ROI区域平均灰度值显著降低至2.7±2.7，而后在24小时逐渐恢复至92.8士13.9。平均灰度值基线显著高于治疗后的0min，15min和30min时间点，但与45min，60min和24h结果相比无显著差异。而US组和Sham组所有时间点的平均灰度值变化在88.2-89.7内，无统计学差异(P＞0.05)。实验组(MB+US)的造影高峰的平均灰度值变化略呈“U”形，即在治疗后几乎陡降为0，而后逐渐上升直至恢复正常的造影前水平。
　　 (2)视觉评分：各组治疗前肝脏血流灌注视觉评分均为0，没有任何差异；Kruskal-wallis检验显示，MB+US、US、SHAM组的统计量分别为37.34、1.26、0，即MB+US组各时间点视觉评分差异具有统计学意义，US、SHAM组各时间点视觉评分差异不具有统计学意义。两两比较的Nemenyi检验结果显示，MB+US组pre时的评分显著优于post、15min的评分，差异有统计学意义(P＜0.05)；post与pre、45min、60min、24h评分差异具有统计学意义(P＜0.05)；15min与pre、60min、24h评分差异具有统计学意义(P＜0.05)；30min与各时间点均无差异(P＞0.05)；45min与post评分差异具有统计学意义；60min和24都与post、15min的评分差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 病理学检查：假照组肝组织未见异常；单纯超声组：偶见肝组织局灶性小片状充血、出血；超声微泡组：大片肝组织出血、肝窦充血、血管壁断裂、内皮细胞条状脱落及血栓形成，中央静脉周围肝细胞水肿、变性。
　　 2.超声空化阻断肿瘤微循环实验结果
　　 各组治疗前超声造影示肿瘤血供丰富，呈高灌注相，少数较大肿瘤内部可见片状充盈缺损。各组肿瘤造影峰值GSV(变化在93.36-96.4)比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。假照组、单纯超声组治疗后即刻及治疗后30min、24h肿瘤仍呈高灌注相，肿瘤组织造影图像灰阶值与治疗前对比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 超声微泡组治疗后即刻超声造影，肿瘤及周边肝组织几乎无造影剂灌注，造影灰阶值显著降低至13.87±10.04(P＜0.05)，治疗后30 min时间点造影可见肿瘤内灌注有部分恢复，但平均灰阶值66.09±21.85仍然显著低于治疗前(P＜0.05)，治疗后24h肿瘤恢复高灌注相(P＞0.05)，与治疗前比较无显著差异(P＞0.05)。
　　 肿瘤体积及凋亡：治疗前各组肿瘤体积(0.37-0.45cm3)无统计学差异(P＞0.05)，治疗后第10d，治疗组、单纯超声组及假照组的肿瘤平均体积分别为1.53cm3、2.27 cm3、2.46 cm3，治疗组显著小于对照组(P＜0.05)。通过TUNEL法检测，微泡超声组治疗后10d凋亡指数明显升高，而单纯超声及假照组凋亡指数相对较低。
　　 结论：
　　 微泡联合脉冲式超声空化治疗仪产生的空化效应可暂时阻断正常肝脏的微循环，并在1小时以内逐渐恢复再通。其机制主要是肝组织充血、出血、血肿血栓形成。微泡诱导的超声空化可以致兔VX2肿瘤微循环阻断，但24h后血流再通明显，其具体发生机制尚不清楚。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写词简表

声明

前 言

第一部分 微泡增强的超声空化阻断正常肝血流灌注的研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分 微泡增强的超声空化阻断兔VX2肿瘤微血管的初步研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

全文总结

参考文献

文献综述一 超声联合微泡造影剂在诊断与治疗肝脏肿瘤领域的研究进展

文献综述二 超声空化效应在治疗中的研究进展

攻读博士期间发表文章情况

致谢