丙型肝炎病毒高变区1对HCV E2蛋白免疫原性抑制作用研究

摘要

一、丙型肝炎病毒高变区1对HCV E2蛋白免疫原性抑制作用研究
　　 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是有包膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科。HCV基因组长约9.6 kb，整个基因组只有一个开放阅读框架，编码的多聚蛋白前体在病毒和宿主蛋白酶的作用下形成结构蛋白(核心蛋白C以及糖基化的包膜蛋白E1、E2)和非结构蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。目前全世界HCV感染者约1.7亿，感染导致的慢性肝病是一个严重的全球性的公共卫生难题。HCV感染的标准疗法是聚乙二醇化的IFN-α与利巴韦林的联合应用，2、3型HCV感染对该疗法的反应率达到75％，但最流行的1型HCV感染的持续反应率不到50％。自HCV基因克隆以来，开发HCV疫苗一直是研究热点，但迄今为止，尚无任何有效的疫苗问世。
　　 研究表明，HCV包膜糖蛋白能够诱使机体产生中和抗体，阻断病毒的入侵。包膜E2蛋白是诱导中和抗体的主要靶抗原，虽然E2蛋白的变异性较高，但近年来在E2中鉴定出了一系列保守的中和抗体表位。高变区1(hypervariable region1，HVR1)是位于E2蛋白氨基末端的由27个氨基酸残基组成的肽段，因序列高度变异而被命名。HVR1是HCV感染所必需的肽段，也是重要的中和抗体靶向位点。HVR1被认为是导致HCV免疫逃避而形成慢性感染的独立影响因素。在HCV感染早期，针对HCV包膜蛋白的抗体主要为HVR1抗体，针对保守表位的交叉中和抗体往往在慢性感染阶段才能检测到。本研究中，我们分别构建了分泌型E2蛋白和删除HVR1的分泌型E2蛋白的表达质粒，通过小鼠免疫，比较二者免疫原性的差异，探讨HVR1对HCV包膜蛋白免疫原性的影响。
　　 方法：
　　 1.构建分泌型E2蛋白和删除HVR1的分泌型E2蛋白表达质粒pCI-1a661、pCI1a661△。
　　 2.将质粒转染HEK293T细胞，用Western、ELISA及免疫荧光检测E2蛋白的表达。
　　 3.用流式细胞术检测HVR1对E2蛋白与SR-B1和CD81结合活性的影响。
　　 4.将质粒免疫小鼠。
　　 5.分别用ELISA和免疫荧光检测小鼠免疫血清中的E2抗体与HVR1抗体。
　　 6.免疫荧光检测小鼠血清对多种HCV基因型E2蛋白的交叉反应性。
　　 7.制备多种基因型的HCVpp，检测小鼠血清的中和活性。
　　 结果与讨论：
　　 1.转染的293T细胞内及培养上清中均能检测到E2蛋白，删除HVR1对E2蛋白的表达、分泌以及构象无明显影响；
　　 2.缺失HVR1使E2蛋白的SR-BI结合活性完全丧失，但增强E2蛋白与CD81的结合活性；
　　 3.pCI-1a661能诱导E2抗体，但其中针对HVR1的抗体占绝对优势；以1a661A作为抗原检测小鼠血清，则pCIla661A诱导的抗体显著强于pCI-1a661；
　　 4.用不同基因型E1E2作为检测抗原，表明缺失HVRl能显著提高E2蛋白诱导交叉中和抗体；
　　 5.HCVpp中和试验表明，pCI-1a661免疫血清的中和作用主要依赖于HVR1抗体，缺失HVR1能显著提高E2诱导交叉中和抗体。这些结果表明：HVR1显著抑制E2蛋白中其他抗体表位的免疫原性，这可能是急性HCV感染者体内难以产生交叉保护性抗体的重要原因，缺失HVR1可显著提高E2蛋白诱导交叉中和抗体，对于研发HCV疫苗有重要意义。
　　 二、一例HBsAg阴性/anti-HBs阳性者全长S基因及HBV基因组的克隆和序列分析
　　 乙型肝炎病毒(HBV)是一种小的双链DNA病毒，属嗜肝DNA病毒科(Hepadnavividae)。乙肝病毒感染肝细胞后，能引起一系列的疾病，如急性肝炎、慢性肝炎，并是肝硬化及肝细胞癌的重要致病因子。全世界HBV感染者达3.5亿之多，我国约一半以上人口感染过HBV，其中慢性感染者约有1.2亿，是严重的公共卫生问题。
　　 HBV DNA复制中存在逆转录过程，因而HBV的变异率明显高于其他DNA病毒。HBV表面抗原是介导HBV感染和诱导中和抗体的关键蛋白，表面抗原基因也是HBV基因组中的热点变异基因，表面抗原基因变异与HBV的免疫逃避以及对核苷类药物耐药密切相关。我们对一例HBsAg阴性、抗-HBs阳性而HBV DNA阳性病例进行了S基因以及全基因组克隆，发现S基因中存在多种不同的变异，其意义值得深入研究。
　　 方法：
　　 1.用PCR法扩增和克隆全长S基因(包括PreS及HBsAg基因)；
　　 2.用PCR扩增和克隆HBV全基因组；
　　 3.对获得的全长S基因不同克隆进行测序和比对。
　　 结果与讨论：
　　 1.获得了17个全长S基因克隆和11个HBsAg基因克隆；
　　 2.比对结果显示，全长S基因存在复杂变异：preS1第58至118位共61位氨基酸缺失突变(这种缺失突变国内外均有报道)，并且，变异株的HBsAg基因中均存在至少一个内部的终止密码子，部分变异株在preS1基因的N末端还存在一个终止密码子，这类变异株为优势毒株(11/17)；部分克隆的HBsAg在第115和116位氨基酸之间插入了NTTT四个氨基酸残基。由于复杂突变的变异株不能产生功能性包膜蛋白， S基因与HBV DNA聚合酶基因完全重叠，而这类变异株为优势毒株，其机制和意义值得深入研究。HBsAg中的NTTT插入突变为首次发现(我们在多例HBsAg和HBV DNA阳性的感染者血清中扩增出)，是否参与HBV的免疫逃避尚待进一步研究阐明。3.获得了7个HBV的全基因组克隆。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略词表

声明

第一部分 丙型肝炎病毒高变区1对HCV E2蛋白免疫原性抑制作用研究

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

参考文献

第二部分 一例HBsAg阴性/anti-HBs阳性乙肝患者者全长S基因及HBV基因组的克隆和序列分析

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

参考文献

综述1 细胞极性与丙型肝炎病毒受体介导的细胞入侵

综述2 乙型肝炎病毒S基因突变的研究进展

致 谢