HMGB1与LPS协同激活类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞产生基质金属蛋白酶的分子机制

摘要

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，以非化脓性增生性滑膜炎为特点，逐渐导致关节软骨的破坏及关节功能的障碍。目前，尚无被证实有导致本病的直接感染因子，但一些细菌、病毒及其代谢产物如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可能通过某些途径影响RA的发病和病情进展。近年来研究显示类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASF)在RA的发生、发展中发挥着T淋巴细胞依赖途径所不可解释的重要作用，如分泌大量促炎细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶，引发滑膜炎症反应、导致软骨基质的崩解。高迁移率族蛋白1(high mobility group box protein1，HMGB1)是一种普遍存在于真核细胞中的染色体蛋白。研究发现，HMGB1可于细胞外分泌释放，参与细胞的分化、迁移和再生，并可介导多种炎症和自身免疫性疾病的发生。在RA患者及实验性关节炎动物关节局部HMGB1的表达明显上调，这些异常表达的HMGB1可通过多种分子机制在关节炎发病的多个环节中发挥作用，介导慢性炎症的持续和局部组织的侵蚀破坏。虽然RASF在关节炎中的作用已得到肯定，但目前尚不清楚HMGB1是否能激活RASF产生破坏侵蚀关节软骨的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及其分子机制。本研究旨在：目的研究HMGB1协同LPS在激活RASF表达MMPs情况，探讨HMGB1协同LPS在激活RASF引起关节损伤的可能途径；初步阐明HMGB1协同LPS激活RASF表达MMPs的分子机制。方法RA患者行滑膜切除术或人工关节置换术时无菌取关节滑膜，分离培养RASF，将培养3—8代RASF用来实验。采用流式细胞仪分析的方法检测RASF给予HMGB1和或LPS刺激后细胞的增殖情况；采用实时定量聚合酶链反应(Real—time RT—PCR)的方法检测RASF中MMP—1、MMP—3、MMP—13、IL—6等mRNA的表达水平。采用酶联免疫吸附实验(enzyme—linkedimmunosorbent assay，ELISA)检测培养上清液中MMP—3、MMP—13和IL—6浓度：采用western blotting分析细胞内NF—κB和磷酸化I—κB、P13K和磷酸化P13K、p38MAPK和磷酸化p38 MAPK等细胞内信号转导分子表达水平的变化；利用受体阻断性抗体(Anti—TLR2和Anti—TLR4)和竞争性融合蛋白(RAGE—Fc)与HMGB1和或LPS刺激RASF共培养，采用Real—time RT—PCR及ELISA分别检测MMP—1、MMP—3、MMP—13和IL—6等mRNA表达水平及MMP—3、MMP—13和IL—6浓度。结果HMGB1和或LPS激活RASF使其进入S期的细胞明显增多，分别为CON：6．55％；HMGB1：8．66％；LPS：8．89％；IL—1β：9．02％；HMGB1+LPS：9．60％；HMGB1+IL—1β：9．96％。激活后RASF与对照组相比MMP—3、MMP—13、IL—6等mRNA水平的表达增高，MMP—1mRNA表达水平无明显差异；培养上清液中MMP—3、MMP—13和IL—6浓度增高。利用受体阻断性抗体(Anti—TLR2和Anti—TLR4)和竞争性融合蛋白(RAGE—Fc)阻断HMGB1目前已知的3个受体来研究HMGB1作用的可能途径，结果发现阻断TLR2受体不影响LPS和或HMGB1激活RASF；而阻断LPS受体TLR4后，RASF不被激活，上清中检测IL—6和MMP—3、MMP—13水平与对照组基本一致；Real—timeRT—PCR检测也显示MMPs等mRNA表达水平没有明显变化。采用竞争性融合蛋白(RAGE—Fc)阻断高度糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)后，HMGB1和LPS协同刺激RASF的效应减弱了，表现为上清液中IL—6和MMP—3、MMP—13浓度较未阻断组明显下降，Real—time RT—PCR检测也显示mRNA水平较未阻断组明显下调；采用SB203580特异性抑制MAPK p38磷酸化后，HMGB1与LPS之间的协同激活RASF作用减弱，采用Bayll—7085特异性抑制NF—κB的活化后，则RASF不被HMGB1与LPS激活；采用Western blotting实验进一步证实了上述推测，HMGB1和LPS联合作用于RASF15min MAPK p38磷酸化水平和NF—κB活化水平显著高于HMGB1或LPS单独作用组，并且用RAGE—Fc融合蛋白预处理可以下调HMGB1和LPS联合作用组MAPK p38和NF—κB蛋白磷酸化水平。结论HMGB1协同LPS激活RASF产生致炎细胞因子和MMPs等导致软骨组织损伤性的酶，并导致细胞生长周期的改变；由于LPS可通过Toll样受体4(Toll—like receptor，TLR4)激活RASF，而RASF表达的TLR4可能同时接受HMGB1和LPS作用。因此，HMGB1可能通过与RASF表面的结合，协同参与LPS的刺激作用；HMGB1是通过结合RAGE增强下游MAPK p38的磷酸化和NF—κB的活化而发挥作用。通过研究HMGB1的胞外作用，探讨其在RASF中产生致炎细胞因子和导致关节破坏的酶的作用和信号转导途径，我们推测，RA时局部异常表达的HMGB1一方面通过激活RASF招募炎性细胞，发挥促炎细胞因子的作用参与局部炎症的启动、放大和维持；另一方面，通过激活RASF参与自身免疫反应，进而参与维持了RA慢性炎症过程，并导致关节组织的侵蚀破坏。
　　 通过上述研究，我们有理由相信，通过分子生物学的手段干预HMGB1在RASF中的信号转导的过程有望缓解RA患者关节炎症的发生，抑制骨与软骨破坏，为临床治疗RA带来希望。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

缩写词表

第一部分 HMGB1激活类风湿节炎滑膜成纤维细胞产生基质金属蛋白酶

材料方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 HMGB1激活类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞产生基质金属蛋白酶的分子机制

方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

附录

综述

参考文献

论文发表情况

致谢