高糖高脂饮食诱导大鼠胰岛细胞的损伤时程变化特征的初步研究及新型抗糖尿病药物DPP-IV抑制剂的筛选

摘要

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种多病因、以高血糖为特征的代谢紊乱综合征。近十年来，DM发病率在全球范围内迅速攀升，由DM并发症导致的死亡人数仅次于心脑血管疾病、恶性肿瘤，成为人类健康的“第三杀手”，又被称为“不死的癌症”。
　　 90-95％DM为2型糖尿病(Type2 Diabetes Mellitus，T2DM)，也称非胰岛素依赖性DM。大量的基础与临床研究表明，胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和胰岛β细胞分泌功能不全是T2DM发病的两个重要病理生理基础。由于胰岛β细胞最终决定T2DM的发展和转归，而现有治疗措施不能有效逆转或防止T2DM患者胰岛β细胞功能的进行性衰竭和丧失。因此，发展具有胰岛β细胞保护作用的抗DM药物成为医药研究的新方向。然而，由于人体胰岛β细胞连续观察的局限性，目前对胰岛β细胞损伤机制的认识仍十分粗浅，缺乏系统性研究。研究表明，DM患者初诊时，其胰岛β细胞功能就仅为正常时的50％，β细胞数量减少约60％。因而，研究DM前或胰岛素耐受形成过程中胰岛β细胞损伤机制具有重要意义。本课题研究目的是：(1)通过对高糖高脂饮食(High sucrose-fat diets，HSFDs)诱导胰岛素耐受大鼠胰岛细胞形态及功能的时程变化特征的研究，了解长期胰岛素耐受对胰岛细胞损伤的规律，为胰岛β细胞损伤的分子机制的研究以及抗DM药物药效学评价提供基础信息；(2)建立分子水平二肽基肽酶-Ⅳ(Dipeptidyl Peptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ)抑制剂的筛选模型，完成本室基于DPP-Ⅳ结构设计合成的新化合物的筛选。
　　 研究工作有两部份内容。
　　 第一部分：HSFDs诱导大鼠胰岛素细胞损伤的时程变化特征的初步研究。
　　 本工作主要基于高糖、高脂诱发IR、损伤胰岛功能，选择国际标准高糖高脂饲料，饲喂Wistar大鼠，诱导胰岛素耐受，共持续59wk。通过动态监测大鼠FBG(Fasting blood glucose，FBG)和糖负荷后2小时后(PBG-2hr)血糖水平，初步判断大鼠IR程度，选择5、17、23、41和63wk，对胰岛形态与D细胞的功能进行研究，包括腹腔注射葡萄糖，观察大鼠Ⅰ相胰岛素分泌能力；对胰腺组织切片进行了胰岛细胞显微、亚显微结构观察；胰岛素、胰高血糖素、BrdU免疫组织化学染色、图像分析；采用多参数免疫磁珠试剂盒测定了胰岛分泌及促分泌激素[胰岛素、胰高血糖素及以高血糖素样肽-1(Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1)]的血清水平。结果如下：
　　 1.HSFDs诱导大鼠的体重增长显著高于正常对照大鼠，差异自实验启动1wk后出现，随时间延长，愈加明显；HSFDs诱导大鼠腹内脂肪积聚明显增多；至实验结束，两组脂体系数分别为(11.33±2.24)％和(6.41±0.66)％。大鼠血脂水平随时间呈缓慢升高趋势，HSFDs在早期(5、17wk)和晚期(41wk后)促进了血清甘油三酯(Triglyceride，TG)升高，在41、63wk作用更为显著。HSFDs不诱发明显的血清总胆固醇(Total Cholesterol，TCH)和游离脂肪酸(Free fatty acids，FFAs)的增加。
　　 2.HSFDs诱导2wk起，大鼠PBG-2hr后血糖水平开始升高，4wk显著高于正常对照大鼠，至12wk血糖水平最高，保持至实验结束。在实验期间，两组动物FBG水平变化总体趋势一致。在10～32wk期间，HSFDs诱导大鼠FBG高于正常对照大鼠，在22～30wk有显著差异；其他时间段两组动物FBG水平基本一致。根据实验全程大鼠PBG-2hr血糖和FBG动态监测的结果，将HSFDs诱导大鼠胰岛素耐受形成及发展过程大致分5个阶段，0～16wk(血糖呈逐渐上升阶段)，16～22wk(血糖峰值保持期)；22～36wk(呈现下降趋势)，36～46wk(血糖谷值保持期)，46wk后(再缓慢升高阶段)。腹腔注射糖耐量结果显示，HSFDs诱导17wk之后，胰岛素Ⅰ相分泌开始降低，到23wk，显著降低；41和63wk有恢复趋势，但外周胰岛素耐受程度明显增强。因此，5、17、23、41和63wk为HSFDs诱导大鼠胰岛素耐受不同阶段的代表性时期。可能代表了耐受形成早期，耐受发展期，FBG紊乱期，代偿期，失代偿期。
　　 3.大鼠胰腺组织显微与亚显微结构观察发现，HSFDs时间依赖性诱发胰岛细胞的损伤，但至63wk，有逆转迹象。Hematoxylin&Eosin(HE)染色结果表明，HSFDs诱导17wk后，大鼠胰岛内部β细胞体积出现膨胀，β细胞数量增多，胰岛体积开始增大；23wk时，HSFDs诱导大鼠胰岛，在形态上表现为胰腺内外分泌部界限模糊，细胞分布不均匀，胰岛细胞开始出现空泡；至41wk时；HSFDs诱导大鼠胰岛结构严重破损，表现为：胰岛团结构松散，胰岛内部异位脂肪沉积，细胞空泡化极严重；至63wk，HSFDs诱导大鼠胰岛形态较41wk有所好转，胰岛细胞重新团聚，脂肪沉积明显减少，核明显增多。电镜观察表明，模型大鼠诱导17wk时，β细胞已经表现出损伤迹象，线粒体表达量增高；23wk时，HSFDs诱导大鼠胰岛在亚显微结构上，表现为胰岛β细胞核出现固缩、深染，胰岛素颗粒减小；至41wk时，β细胞核出现固缩、深染且边缘化，线粒体膨胀、脊结构紊乱。HSFDs对胰岛α细胞亚显微结构的影响较β细胞弱，由于获得的有效细胞数量较少，未能观察到HSFDs对α细胞的显著影响，仅观察到，17wk模型大鼠α细胞核皱缩，细胞内胰高血糖素分泌颗粒比正常对照小；61wkα细胞内胰高血糖素分泌颗粒明显减少，这一现象也与测定的血清胰高血糖素含量的变化规律相吻合。
　　 4.胰岛组织切片免疫组化染色结果显示，胰岛细胞增殖主要与鼠龄相关，HSFDs诱导大鼠仅在41wk时，新生细胞增殖数量高于同期正常饮食大鼠，在63wk时，细胞增殖数量明显减少；HSFDs诱导时间依赖的增加大鼠胰岛素的合成，至41wk、63wk差异显著。而胰高血糖素仅在63wk呈现合成增加的现象。血清胰岛素、胰高血糖素及GLP-1检测发现，HSFDs明显促进胰岛素分泌，并呈现时间依赖性升高趋势；HSFDs时间依赖地降低血清GLP-1水平；与胰岛α细胞胰高血糖素合成增加相反，63wk时，HSFDs饮食大鼠血清胰高血糖素水平显著降低。
　　 综上所述，本课题采用HSFDs成功诱导了胰岛素耐受大鼠，该大鼠同时以腹部肥胖和血清TG紊乱为特征。在持续59wk的胰岛素耐受病程中，大鼠IR程度日趋严重，胰岛素合成和分泌量时间依赖性增加，但并未诱发出高糖血症。伴随胰岛耐受的发展，HSFDs诱发大鼠胰岛细胞进行性损伤，表现为17wk出现胰岛细胞膨大，23wk胰岛素急性分泌功能一过性降低，41wk细胞结构损伤最严重并开始出现代偿性增生，至63wk逐渐失代偿。HSFDs与DM的胰岛细胞损伤特征不同。此外，本实验发现，伴随大鼠月龄增加，正常饮食大鼠同样出现胰岛素耐受现象，63wk时，其胰岛素耐受程度与HSFDs诱导17～23wk的大鼠相当，但其新生胰岛细胞数量明显增加，形态仅有膨胀、细胞空泡变性及偶有纤维化的现象。
　　 第二部分：新型抗DM新药DPP-Ⅳ抑制剂的筛选。
　　 通过诱导Caco-2细胞分化高表达DPP-Ⅳ，建立分子水平DPP-Ⅳ抑制剂的筛选方法，对本实验室靶向DPP-Ⅳ设计合成的143个新化合物进行了筛选；采用正常昆明(KM)小鼠、肝脏葡萄糖激酶敲除DM小鼠模型以及小鼠急性毒性试验对活性化合物的体内降糖活性和选择性进行了筛选。结果表明，来源于分化Caco-2细胞的DPP-Ⅳ的粗制酶具有较好的活性，建立的分子水平的筛选模型能够高通量地用于抑制剂的筛选；143个受试化合物中，化合物Max-1、Max-2和143的活性较高，其IC50分别为294.36±31.08(nM)、340.44±42.53(nM)和267.75±14.06(nM)，和阳性药相似；然而口服给予KM小鼠和肝脏葡萄糖激酶敲除DM小鼠，10mg/kg的Max-1、Max-2均未表现出降低糖负荷后血糖水平的作用，相反，Max-1和Max-2分别在DM小鼠和KM小鼠上表现出现升高糖作用。小鼠急性毒性结果表明，口服化合物Max-1、Max-2和143的LD50分别为15.6mg/kg、35mg/kg和15.6mg/kg，毒性较强。
　　 综上所述，成功建立了DPP-Ⅳ抑制剂筛选模型，完成了143个化合物的体外筛选，发现了3个体外具有较强DPP-Ⅳ抑制活性的化合物。其中Max-1和Max-2体内无活性，可能为非选择性抑制剂。新DPP-Ⅳ抑制剂仍有待进一步的优化。