驻极体和化学促渗剂对环孢菌素A的体外促渗研究

摘要

经皮给药系统（transdermAldrug delivery systems，TDDS）是指在皮肤表面给药，使药物以一定的速率通过皮肤各层，经毛细血管吸收进入体循环产生全身或局部治疗作用的一种新型给药系统。自从1981年第一个经皮给药系统——东莨菪碱经皮吸收贴剂上市以来，随着药物缓释理论、压敏胶材料学、体内药物分析学、生物药剂学及其相关技术的不断进步，利用皮肤作为药物输入体循环的现代经皮给药吸收技术得到飞速发展，它包括物理促渗技术（离子导入、电穿孔、超声、微针、激光和驻极体等）、化学促渗技术（氮酮等各类化学促渗剂）和药剂学方法（微乳、脂质体、纳米粒和前药的应用）等。随着生物技术和遗传工程的发展，蛋白质与多肽类药物的研究与开发已成为医药工业中的一个重要领域，但由于这类药物稳定性差，生物半衰期短，常以多聚体形式存在和不能口服给药等缺点，导致其生物利用度不高，基本局限于注射给药，限制了它的广泛应用。为了减轻患者的身体、心理和经济负担，研究人员正致力于寻找此类药物的非侵袭性(non-invasive)给药方式，即所谓的非注射给药方式。驻极体（Electret）是一类能够长期储存空间电荷和偶极电荷的功能电介质材料。驻极体透皮促渗技术是利用驻极体产生的持续稳定的静电场和微电流使皮肤角质层脂质双分子间形成暂时可逆的通道及拓宽毛囊孔径来实现增加药物通透量的一种经皮给药方法。作为一种安全有效的物理促渗方法，驻极体既具有类似于离子导入法产生的微电流作用于药物，促进离子型药物的经皮吸收，又具有类似于电致孔法的静电效应作用于皮肤的角质层导致诸多新增孔道的形成，有利于药物的经皮渗透，它为离子型药物和大分子多肽类药物的经皮吸收提供了广阔的应用前景。随着驻极体经皮促渗研究的不断深入和蛋白质多肽类大分子药物新剂型研发的迫切需求，自2010年开始驻极体经皮给药研究从分子量小于500Da的模型药物逐渐向分子量大于1000Da的药物扩展。以环孢菌素A （1202.63Da）和胰岛素（5807.69Da）为模型药物，研究驻极体及其制剂对上述两种药物经皮吸收的研究工作已经展开，这为拓展驻极体促渗技术的应用领域开辟了新天地。为了系统研究驻极体对蛋白多肽类药物的促渗效果，考察不同极性和不同表面电位的驻极体及驻极体与化学促渗剂联用的促渗效果，阐明驻极体透皮促渗机理，为研制驻极体蛋白质多肽类药物透皮给药新剂型提供理论和实验依据，本文以环孢菌素A为模型药物，以聚丙烯（polypropylene，PP）薄膜为材料，通过电晕充电技术将聚丙烯制备成不同极性和不同表面电位的驻极体，利用等温表面电位衰减测量研究了PP驻极体的电荷储存稳定性；借助于体外透皮实验和高效液相色谱技术对驻极体与化学促渗剂（氮酮、油酸乙酯和甘油单油酸酯）单独使用和联合使用的促渗效果进行比较研究；通过倒置相差显微镜探讨了驻极体对皮肤微观形态和结构的改变；通过开路热刺激放电和差示量热技术研究了驻极体透皮促渗机制，为后期优化环孢菌素A 驻极体贴剂的研制提供理论依据和实验支持。
　　 驻极体电荷储存稳定性的研究结果表明：1）PP 驻极体的等效表面电位随时间呈指数规律衰减。2）注极栅压越高，双裸面驻极体的电荷储存稳定性越差。3）PP驻极体具有优异的电荷储存稳定性，适合用于环孢菌素A 体外经皮给药研究。利用改良的Franz 扩散池和高效液相色谱技术，比较研究了不同极性和不同表面电位驻极体和常用的化学促渗剂（氮酮、油酸乙酯、甘油单油酸酯）对环孢菌素A的透皮吸收规律，并进一步考察了驻极体与化学促渗剂联合使用对环孢菌素A 透皮吸收的影响。结果显示：1）正∕负极性驻极体作用离体皮肤24h后，+2000V 驻极体、-1000V 驻极体对环孢菌素A的累积渗透量最大，分别为9.4083 μg/cm2和9.2753μg/cm2，是环孢菌素A 自然透皮（对照组）累积渗透量6.2835 μg/cm2的1.50倍和1.48倍；+2000V 驻极体和-1000V 驻极体对环孢菌素A的稳态透皮速率Js分别为0.5364 μg/cm2 ?h和0.4822 μg/cm2 ?h，增渗倍数（相对于对照组(Js=0.3529 μg/cm2 ?h)）为1.52和1.37，这说明驻极体对环孢菌素A的经皮给药具有一定的促渗作用。2）与对照组相比，1％氮酮、3％氮酮、5％氮酮、10％甘油单油酸酯和10％油酸乙酯分别作用于皮肤24h，环孢菌素A的稳态透皮速率分别是对照组的6.72倍、2.11倍、1.43倍、7.735倍和14.55倍（即透皮增渗倍数）（P<0.05），从大到小依次为：10％油酸乙酯>10％甘油单油酸酯>1％氮酮>3％氮酮>5％氮酮；累积渗透量从大到小依次为：10％油酸乙酯>1％氮酮>10％甘油单油酸酯>3％氮酮>5％氮酮。3）不同极性不同表面电位驻极体与不同化学促渗剂联合使用对环孢菌素A 经皮促渗24h后，不同的驻极体与3种浓度的氮酮分别联用后均没有表现出协同促渗作用，而±500V 驻极体+10％甘油单油酸酯联用组以及±2000V 驻极体+10％油酸乙酯联用组促渗效果是各自联用组中最优异的，增渗倍数分别为空白对照组的8.87倍和19.59倍，促渗能力由大到小依次排序为±2000V 驻极体+10％油酸乙酯联用组>±500V 驻极体+10％甘油单油酸酯联用组（P<0.05）。另外，10％油酸乙酯增渗倍数为14.55倍，与±2000V 驻极体+10％油酸乙酯联用组的增渗倍数ER为19.59倍相比有明显差异（P<0.05），即±2000V 驻极体与10％油酸乙酯联用后表现出优越的协同促渗作用。基于驻极体在经皮给药中表现出的良好促渗效果，本文通过倒置相差显微镜观察了经驻极体作用后大鼠皮肤显微形态和结构的改变，以及通过开路热刺激放电技术和差示量热技术探讨了驻极体的透皮促渗机制。倒置相差显微镜观察的结果显示：±1000V 驻极体分别作用大鼠皮肤2～16h 过程中，皮肤的显微结构发生了明显改变，主要表现为皮肤角质层变薄，角质层之间连接松散，角质层外层细胞易脱落。正负极性驻极体使大鼠皮肤显微结构的变化趋势基本一致，大鼠皮肤显微结构的变化程度随驻极体作用时间的增加而显著。驻极体通过改变皮肤的屏障功能、增加皮肤的通透性和加快药物的经皮渗透速度，达到促进药物经皮吸收的目的。开路热刺激放电技术（TSD）的研究结果表明：-500V 驻极体通过改变皮肤角质层类脂的层状排列和流动性，以及蛋白质的空间结构，调控皮肤的驻极态，从而降低了角质层的屏障功能，疏通了一定的透皮通道，有利于药物的经皮渗透及其驻极体透皮制剂的研发。差示量热技术（DTA）的研究结果表明：±500VPP 驻极体、±1000VPP 驻极体和±2000V PP 驻极体利用外静电场和微电流效应不同程度地改变了大鼠皮肤角质层中层状类脂和蛋白质的空间结构，使脂质从凝胶态向液晶态发生相变，从而增强类脂的流动性和协同性。此外，驻极体使蛋白质发生空间构象的改变，导致肽链从右手螺旋结构转变为垂直伸展并平行排列的肽链结构，为经皮促渗打开了渗透孔道。总体而言，在脂质调控方面，负极性驻极体较正极性驻极体有更强的生物效应，-500V～-1000V 驻极体的作用效果较明显，并且-500V 驻极体在综合调控大鼠皮肤结构方面的效果更优异。在蛋白质结构调控方面，+1000V～+2000V 驻极体表现出较明显的作用效应。驻极体引起皮肤角质层微观结构的改变具有一定的“电压窗口效应”。本文首次通过体外促渗实验系统研究了不同极性不同表面电位的驻极体、常用化学促渗剂以及不同极性不同表面电位驻极体与化学促渗剂联合使用对环孢菌素A 透皮吸收的影响，发现驻极体与化学促渗剂联用对多肽类药物环孢菌素A 具有良好的协同促渗作用。倒置相差显微镜和热分析技术的研究结果进一步显示驻极体对皮肤显微结构和驻极态具有显著的调控作用。实验表明：驻极体具有优良的药物透皮吸收促进作用，可作为一种方便有效的促渗方法用于蛋白质多肽类药物经皮给药新剂型的研究。本课题受国家自然科学基金（No.：50977089, 2010-2012）、上海市自然科学基金（No.：10ZR1437600, 2010-2011）和军队“十一五”国际合作课题(No.：06H022, 1996-2010)资助。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 经皮给药系统

第二章 驻极体促渗技术

第三章 驻极体实验方法和电荷储存稳定性研究

第四章 环孢菌素A 透皮给药的实验技术和方法

第五章 驻极体促进药物透皮吸收机制的研究

第六章 总结和展望

参考文献：

综述 蛋白多肽类药物经皮给药的物理学方法

硕士期间发表的论文

致 谢