基于代谢组学技术的晕动病发生机制探讨

摘要

晕动病是指机体暴露于异常加速度运动而引起的以植物神经反应（恶心、呕吐、眩晕）为主的症状和体征。晕船作为晕动病最常见的一种形式，虽不致于造成生命危险，但它导致舰船工作人员极度不适，加重体力消耗，造成过度疲劳，严重影响舰船工作人员的工作效率,是海上事故发生的重要原因之一,也是部队登岛作战非战斗减员的主要因素，因此晕动病发生机制研究一直受到国内外尤其是军队的重视。迄今为止用于解释晕动病发生机制的理论主要有感觉冲突-失匹配理论，毒物探测假说，神经递质假说，牵涉性内脏不适假说等。上述几种理论都没有完全阐明晕动病发生的机制。
　　 应激可以引起机体血清代谢产物的变化。有研究表明，晕动病发生过程中存在着应激反应，其过程中代谢产物变化规律还不明确。研究证实，血液中代谢产物可以反映机体的正常生理变化和疾病的病理生理影响，有助于阐明其潜在的分子机制。
　　 目的：
　　 本实验运用代谢组学方法了解加速度暴露过程中出现晕动病症状受试者和没有出现晕动病症状受试者暴露前后的血液代谢产物的变化规律，同时观察血液中调控代谢的应激激素在异常加速度暴露前后的变化规律, 并在此基础上通过动物实验观察上述代谢产物及调控代谢的应激激素的变化对机体加速度暴露耐受力的影响，为阐明加速度暴露后晕动病的发生机制提供线索。
　　 方 法：
　　 1．晕动病与无晕动病人群加速度暴露前后血清代谢产物比较
　　 1.1受试对象和伦理学声明
　　 在我陆军某营招募男性志愿者60名。所有受试对象均同意参加试验并填写《知情同意书》。本试验经我校(第二军医大学)伦理委员会同意进行。实验前24小时禁食高嘌呤含量的食物和碳酸饮料。试验前一天18点晚餐后停止进食，21点统一就寝。
　　 1.2加速度暴露
　　 受试者在测量血压、心率、身高、体重、体温之后，分4批进入六自由度舰船运动模拟器(舱长3m，宽4m，高2.5m), 入座, 适应5分钟后进行加速度（正弦波，频率0.26HZ，加速度0.27g）暴露15分钟。试验时间为上午9:00至10:30。当时环境温度为15.2℃，舱内温度为18.0℃。加速度暴露后，我们将出现恶心、呕吐症状的受试者作为晕动病组，未出现恶心、呕吐的受试者作为无晕动病组。
　　 1.3 血液样品GC-TOF/MS分析
　　 分别采集受试者加速度暴露前和加速度暴露后即刻的静脉血各5ml，4℃离心20min（3000rpm），取上清液，置于-80℃保存。取血清 100μL，加入内标氯苯丙氨酸和十七酸各10μL，震摇均匀；加入氯仿和甲醇的混合溶剂（氯仿：甲醇=3：1）300μL，再次震摇均匀，-20℃静置 10min，室温离心 10min (10,000rpm)；取 300μL上清液置于进样瓶，真空干燥。在干燥后的进样瓶中加入 80μL含甲氧胺（15mg/mL）的吡啶溶液，在37℃下反应90min，再加入 80μL BSTFA（含1％TMCS），于 70℃下反应 60min后进样分析。
　　 本实验采用GC-TOF/MS (LECO Corporation, St. Joseph, MI, USA) 检测血液样品中的代谢物。加速度暴露前后样本间隔进样。GC进样口温度：270℃。载气为超纯氦。流量为1ml/min。MS接口温度：260℃。离子源温度：200℃。质谱扫描范围:30～600（M/Z）。气相色谱的程序升温条件：起始温度：80℃，保留2分钟，10℃/min升至180℃，6℃/min升至230℃，40℃/min升至295℃，保留9分钟。
　　 1.4 数据分析
　　 检测所得数据首先通过DataBridge软件（Perkin-Elmer Inc.）直接转化成NETCDF格式，然后输入MATLAB(The MathWorks, Inc.)进行基线校正、峰识别、对齐、内标排除和均一化，得到一个由指定的峰序列号、观测点以及归一化后的峰强度组成的三维矩阵，然后将其导入SIMCA-P软件后进行多维统计分析。我们运用PCA观察样品的聚集、离散和离群点，通过OPLS-DA来鉴别造成聚集和离散的主要差异变量。同时，为了保证在单维统计上有意义，运用配对t检验和Wilcoxon符号秩检验来检验得到的主要差异变量，以两者P值均小于0.05的变量作为检验标准。运用配对t检验或Wilcoxon符号秩检验分析上述主要差异变量在两组各自暴露前后的变化水平, 运用独立样本t检验或Wilcoxon秩和检验分析暴露前两组人群之间和暴露后两组人群之间上述主要差异变量的变化特点。
　　 2.晕动病与无晕动病人群加速度暴露前后血清中调控代谢的应激激素比较
　　 2.1放射免疫法测定血清中胰岛素、胰高血糖素、皮质醇含量
　　 胰岛素、胰高血糖素和皮质醇放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
　　 2.2 ELISA测定血清中肾上腺素含量
　　 肾上腺素ELISA试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司。
　　 3.血糖浓度变化对实验大鼠晕动病严重程度的影响
　　 3.1实验动物分组
　　 雄性SD大鼠（250-300g），购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。对100只大鼠进行加速度暴露30min，记录晕反应指数。根据晕反应指数选出晕动病敏感大鼠（晕反应指数>9）作为实验大鼠，脱适应14天后，再将其随机分为三组：模型组（n=14）：单纯给予加速度刺激；胰岛素组（n=14）：加速度刺激前30分钟，给予大鼠腹腔注射胰岛素（1unit/kg）；空白对照组（n=8）：不给予加速度刺激。
　　 3.2 加速度暴露
　　 将模型组和胰岛素组大鼠放入按Crampton等报道仿制的旋转装置内，绕垂直轴顺时针旋转，以16°/s2 角加速度加速至120°/s2，再以48°/s2角减速度减速至零，交替加、减速进行，持续30分钟。
　　 将空白对照组大鼠放入旋转装置，静置30分钟。实验结束后立即检测大鼠的晕反应指数并断头处死，测量血糖值。大鼠血液样本4℃离心20min（3000rpm），取上清液，置于-80℃保存。
　　 3.3 晕反应指数评分标准
　　 晕反应指数评分标准：排粪（粒）无计为0分，有，每粒计1分；排尿无计0分，有计1.2分；立毛无计0分，轻度计0.6分，重度计1.2分；颤抖无计0分，有计1.2分。晕反应指数评分为各项积分的总和。
　　 3.4 使用罗氏全活力型血糖仪测定大鼠血糖值。
　　 3.5大鼠血清胰岛素、胰高血糖素、皮质酮和肾上腺素含量检测方法同人体试验。
　　 4.统计分析
　　 自身暴露前后数据比较采用配对t检验或Wilcoxon符号秩检验; 暴露前或暴露后两组间的数据比较采用独立样本t检验或Wilcoxon秩和检验。三组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD Post hoc。
　　 结 果
　　 1．晕动病与无晕动病人群加速度刺激前后血清代谢物组比较
　　 1.1晕动病发生情况
　　 加速度暴露后有30名受试者出现了明显的晕动病症状，还有30名受试者没有出现明显的晕动病症状。
　　 1.2 60名受试者自身加速度暴露前后血清代谢物组比较
　　 60名受试者加速度暴露后血清中有35种代谢物与其自身暴露前相比发生了变化，血清中肌苷、次黄嘌呤、尿素、乙醇酸、肌酸肝、丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、4-羟基-脯氨酸、肌酸酐、3-羟基异丁酸、碳二亚胺、反丁烯二酸、L-2-氨基丁酸、焦谷氨酸水平明显降低，而血清亚油酸、硬脂酸、反油酸、棕榈酸、油酸、花生四烯酸、n-十二烷酸、n-十四烷酸、β-羟基丁酸、丙酮酸、葡萄糖含量明显升高。
　　 1.3 晕动病组与无晕动病组受试者加速度暴露前后自身血清35种代谢产物变化水平比较
　　 为探索两组受试者可能存在的生理变化或病理生理变化特点，我们对晕动病组和无晕动病组受试者各自暴露前后上述35种代谢产物的变化状况进行了比较。两组受试者加速度暴露后包括葡萄糖、丙酮酸在内的26种代谢产物发生了相同的变化。同时我们发现两组间有9种代谢产物在加速度暴露变化趋势不一致。无晕动病组受试者血清尿素含量明显降低，而晕动病组则没有明显变化。相反，晕动病组受试者血清组氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、酪氨酸、反丁烯二酸、焦谷氨酸含量明显降低，血清n-十二烷酸、n-十四烷酸含量明显升高，但无晕动病组加速度暴露前后上述代谢物含量却没有发生明显变化。
　　 1.4加速度暴露前晕动病组与无晕动病组受试者间血清中35种代谢产物含量的比较
　　 在加速度暴露前，晕动病组人群血清中组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸以及鸟氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，酪氨酸，焦谷氨酸以及反油酸，亚油酸，次黄嘌呤，肌酸肝，丙酮酸、3-羟基异丁酸、碳二亚胺的含量均明显高于无晕动病组。
　　 1.5 加速度后晕动病组与无晕动病组受试者间血清中35种代谢产物含量的比较
　　 加速度暴露后，晕动病组受试者血清中异亮氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、肌酸肝、次黄嘌呤、丙酮酸、4-羟基-脯氨酸、油酸、尿素、葡萄糖含量明显高于无晕动病组受试者。加速度暴露前的4-羟基-脯氨酸、油酸、尿素、葡萄糖血清含量在两组人群之间没有显著差异，但加速度暴露后晕动病组受试者血清中上述代谢物的含量明显高于无晕动病组, 且在这4种代谢产物中，晕动病组受试者加速度暴露后葡萄糖的升高幅度要明显大于无晕动病组（P<0.05）。
　　 2.晕动病与无晕动病人群加速度暴露前后血清中调控代谢的应激激素比较
　　 加速度暴露后晕动病组和无晕动病组受试者血清皮质醇和肾上腺素含量均较各自暴露前明显升高，其中晕动病组皮质醇含量升高30％ (P<0.001)，肾上腺素含量升高24％(P<0.001)，而无晕动病组皮质醇含量升高26％(P<0.001)，肾上腺素含量升高18％ (P<0.001)。另外，两组人群暴露前血清胰岛素含量存在差异，即无晕动病组血清胰岛素含量明显高于晕动病组 (P<0.05)。与各自暴露前相比，加速度暴露后无晕动病组人群血清胰岛素含量下降了33％ (P<0.01)。晕动病组仅下降了17％ (P<0.01)。两组受试者加速度暴露前后胰高血糖素含量没有明显变化，但无晕动病组（P<0.001）和晕动病组(P<0.05)。加速度暴露后胰高血糖素与胰岛素的比值较各自暴露前明显升高，而且无论是暴露前(P<0.01)还是暴露后(P<0.05)，无晕动病组胰高血糖素水平和胰高血糖素与胰岛素的比值均明显低于晕动病组。
　　 3.血糖浓度变化对实验大鼠晕动病严重程度的影响
　　 胰岛素组大鼠胰岛素水平是模型组的3.88倍(P<0.001)，是空白对照组的2.57倍(P<0.001)，血糖水平明显低于模型组(P<0.001)和空白对照组(P<0.001)，晕反应指数与模型组相比降低了33％(P<0.05)，但与空白对照组相比没有明显差异。加速暴露后胰岛素组大鼠糖皮质激素、肾上腺素水平较空白对照组分别升高了49％(P<0.01)和421％ (P<0.001)，但与模型组相比没有明显差异。三组大鼠血清胰高血糖素水平虽然没有明显差异，但胰岛素组大鼠胰高血糖素与胰岛素比值，与模型组相比降低了71％ (P<0.001),与空白对照组相比降低了58％(P<0.001)。
　　 结 论：
　　 1.加速度暴露后60名受试者有35种代谢产物发生了明显变化，主要包括在嘌呤代谢，氨基酸代谢，脂肪酸代谢和糖代谢通路中。
　　 2.加速度暴露后，两组受试者有9种代谢产物变化有差异，这些代谢产物主要有：4种生糖氨基酸（组氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、酪氨酸）、2种脂肪酸（n-十二烷酸、n-十四烷酸）以及尿素、反丁烯二酸和焦谷氨酸。
　　 3.晕动病人群血清中葡萄糖加速度暴露后的升高幅度明显大于无晕动病人群；加速度暴露过程中血糖浓度的大幅度升高可能与晕动病的胃肠道症状发生有关。
　　 4.加速度暴露可以导致两组受试者血清中皮质醇和肾上腺素含量明显升高，胰岛素含量明显下降，胰高血糖素与胰岛素比值明显升高；加速度暴露前，晕动病组受试者胰岛素水平低于无晕动病组，胰高血糖素/胰岛素比值高于无晕动病组。
　　 5. 加速度暴露前给予大鼠胰岛素可缓解加速度暴露过程中血糖浓度的升高幅度，明显减轻晕动病的胃肠道症状。
　　 综合上述研究，提示无晕动病组暴露前较高的胰岛素水平可能缓解加速度暴露过程中血糖的升高幅度，减轻晕动病的胃肠道症状，其具体机制还有待于进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

声明

前 言

第一部分 晕动病与无晕动病人群加速度暴露前后血清代谢产物比较

第二部分 晕动病与无晕动病人群加速度暴露前后血清中调控代谢的应激激素比较

全文总结

综 述

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致 谢