粪便中基因诊断胰腺癌的方法研究

摘要

胰腺癌是一类高度恶性肿瘤。近年来，全世界范围内胰腺癌的发病率呈现出逐年上升的趋势。在美国，胰腺癌居恶性肿瘤死亡原因的第4 位，居消化道肿瘤死亡原因的第2 位，在我国胰腺癌现已经成为常见的恶性消化道肿瘤之一。由于胰腺癌的病理及生理学特点，临床症状缺乏特异性表现，早期诊断相当困难。虽然近年来影像学检查肿瘤标志物的进展较快。但临床上胰腺癌的早期诊断率仍然较低。胰腺癌发病率有逐年增加趋势，然而诊断进展却十分缓慢，故而胰腺癌切除率仍很低，手术切除率仅为20％～30％，手术5年生存率仍在18％以下，因此，发现及发展新的筛选以及诊断手段，综合分析胰腺癌高危人群，提高胰腺癌的早期诊断率是改善胰腺癌预后的关键，早期胰腺癌一般是指肿瘤直径≤2cm，而且局限于胰腺实质内，无胰腺外浸润及淋巴结转移。目前，临床上的小胰腺癌并不一定是早期胰腺癌，小胰癌(small pancreatic cancer)仅针对肿瘤的大小而言。直径≤2cm 胰腺癌，而不管是否有胰外浸润或是淋巴结转移。并且还有学者将直径≤lcm 胰腺癌定义为微小胰癌(minute pancreatic cancer) [1, 2]。
　　 肿瘤在发生发展过程中有多种基因的参与，胰腺癌也不例外。对这些发生变化的基因进行研究可以为胰腺癌的早期诊断提供新的肿瘤分子标志物，基因诊断的研究现已成为胰腺癌研究领域的热点之一。研究报道胰腺癌相关的基因目前主要限于基础研究，临床研究尚处于起始阶段。这些基因主要包括K-ras基因、端粒酶、DPC4和p53基因等，标本来源包括胰腺癌组织、胰液脱落细胞、胰管细胞刷刷检标本、细针穿刺标本等。应用简便又非侵入性的方法进行人群筛查是目前胰腺癌急需解决的课题。本研究目的旨在通过粪便这一无创性的手段进行检测胰腺癌中多基因分子标志物（microRNA、ALU repeats、k-ras gene）的表达变化，建立适合临床应用的高效、简便、快捷的胰腺癌诊断方法。我们抽提了粪便中的DNA和RNA，建立了针对microRNA和ALU repeats的实时定量方法，以及PNA-PCR 定性方法。结果表明，（1）
　　 胰腺癌相对于正常对照，粪便中miR-181b, miR-196a和 miR-210表达丰度相对增高（p＜0.05），诊断价值方面，在鉴别诊断胰腺疾病和正常对照，miR-181b和 miR-210的表达差异具有统计学意义（p＜0.05）。在胰腺癌与临床因素关系分析中，我们发现miR-196a与肿瘤最大直径相关(Spearman r=0.516, p=0.041)。（2）胰腺癌患者粪便ALU 序列表达量高于慢性胰腺炎以及正常对照的表达量(p＜0.05)。胰腺癌患者与慢性胰腺炎和正常人群鉴别诊断，其诊断评估 AUC-ROC为0.748％（95％ CI:
　　 0.661-0.835），敏感性为：75.6％，特异性为67.1％，胰腺癌患者与慢性胰腺炎和正常对照相比较差异有统计学意义（p＜0.05）。（3）在112例收集的胰腺癌患者中，k-ras基因突变率为55.4％（62/112），慢性胰腺炎患者共89例，其k-ras基因突变率为22.4％（20/89），二者相比差异有统计学意义（p＜0.05），k-ras基因突变对胰腺癌诊断的敏感性为55.4％（62/112），特异性为77.5％（69/89），血清CA199在胰腺癌患者中有92例患者＞37U/ml，诊断胰腺癌的敏感性为82.1％（92/112），特异性为86.5％（77/89），联合粪便k-ras基因检测和血清肿瘤标志物CA199 检测，敏感性为87.5％(98/112)，特异性为76.4％(68/89)。在诊断价值方面，K-ras基因突变联合CA199水平检测胰腺癌与单独CA199 相比，差异无统计学意义（p＞0.05），但是相对于早期胰腺癌来说，二者差异有统计学意义（p＜0.05），说明k-ras基因对早期胰腺癌可能有一定的诊断价值。
　　 有关胰腺癌患者粪便的基因检测作为筛选手段，国内外虽已开始着手研究，认为肿瘤细胞可能比正常细胞更能耐受降解过程，使粪便基因分析成为可能[3]，但PCR 扩增成功率低，结果不稳定，很难用于大面积筛选[4]。我们旨在对传统粪便DNA及RNA 提取方法进行改良，提高其PCR 扩增成功率，进一步评价粪便的基因检测在胰腺癌筛选中的价值。粪便中基因检测有望成为一种新的胰腺癌的简便、无创性、廉价的筛查方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

声明

前 言

第一部分粪便中microRNAs 表达检测诊断胰腺癌的价值评价

第二部分粪便中ALU 序列定量检测诊断胰腺癌的价值评价

第三部分粪便中K-ras 突变的肽核酸钳制PCR 检测的方法建立及胰腺癌诊断的价值评价

参考文献

全 文 总 结

文献综述胰腺癌早期诊断的实验研究进展

在读期间发表论文

致 谢