hSu1f-1基因抑制肝癌SMMC-7721细胞迁移和增殖的机制探讨

摘要

研究背景与目的：
　　 肝癌的发生发展和转移与多种基因的突变和表达改变密切相关，与多种信号通路的激活或抑制密切相关。硫酸乙酰肝素(heparinsulfate，HS)，又名葡糖胺聚糖链，是具有电负性的大分子线性聚合物，通过共价键与核心蛋白的丝氨酸甘氨酸残基结合，构成硫酸乙酰蛋白聚糖(HSPG)。HSPG是胞外基质中调控肝素结合生长因子信号通路的重要组成成分。而hSulf-1是可降解乙酰肝素的内硫酸酯酶，是一个新的肿瘤抑制因子，可能参与肿瘤发生发展过程。PI3K/AKT与ERK信号通路对于维持和促进细胞生长、增殖、凋亡等是必不可少的。本研究用病毒感染方法使hSulf-1在肝癌细胞系SMMC－7721中重新表达，观察是否能够降低PI3K/AKT、ERK等信号通路蛋白的表达，抑制细胞的增殖、迁移，并研究hSulf-1在肝癌组织及其癌旁组织中的表达和临床意义，进一步探讨hSulf-1抗肝癌的作用及其可能的机制。
　　 方法：
　　 1.培养SMMC-7721细胞，并以不同的感染复数(MOI)，即MOI=50和100感染hSulf-1腺病毒，以Ad－EGFP为对照病毒，MOI=50；空白组为空白对照；
　　 2.感染48h后收集细胞提取蛋白，Westernblot分析PI3K/AKT及ERK通路等信号蛋白表达变化情况；
　　 3.利用划痕实验，将相关病毒以上述感染方式感染SMMC-7721细胞，划痕后48h检测hSulf-1对SMMC-7721细胞迁移能力的影响；
　　 4.MTT检测相关病毒感染48h后，hSulf-1对SMMC-7721细胞增殖情况影响；
　　 5.收集70例HCC组织样本经临床病理分期分级后，以免疫组织化学方法检测HCC组织和癌旁组织中hSulf-1的表达情况，分析hSulf-1表达与患者临床病理参数之间的相关性，统计各组病人的生存时间并绘制生存曲线。
　　 结果：
　　 1.WB结果表明Ad-hSulf-1感染组较空白组及对照空病毒组相比，hSulf-1蛋白表达增高，p-AKT、p-ERK等蛋白表达降低，PTEN蛋白表达增高，且MOI=100较MOI=50效果更明显。
　　 2.划痕试验结果表明空白对照细胞迁移距离为637±30.5um，Ad－EGFP感染48h后细胞迁移距离为470±60.8um，Ad-hSulf-1处理48h后，SMMC-7721细胞迁移距离为317±51.3um(MOI=50)，233+32.1um(MOI=100)，hSulf-1处理后的细胞迁移距离明显降低。
　　 3.MTT结果显示，Ad－EGFP(MOI=50)和Ad－hSulf-1(MOI=50和100)处理48h后SMMC-7721细胞的增殖抑制率分别为27.37％、33.84％、47.81％。
　　 4.免疫组化结果显示，hSulf-1表达于细胞浆，染色均匀。70例肝癌组织标本中，阳性率为100％，其中高表达为17例，高表达率为24.3％；相应癌旁组织中阳性率为100％，其中高表达31例，高表达率为44.3％。hSulf-1的表达与患者肝硬化及病理分级等临床病理参数之间具有相关性，生存分析显示hSulf-1高表达的患者中位生存期为38个月，低表达患者中位生存期为27个月。
　　 结论：
　　 1.hSulf-1能够降低肝癌细胞系中AKT及ERK磷酸化水平，下调PI3K/AKT、ERK等信号通路活化程度，抑制SMMC－7721细胞的迁移和增殖。hSulf-1可能通过抑制细胞的增殖和侵袭能力来抑制肿瘤的形成。
　　 2.hSulf-1在肝癌组织中表达较癌旁组织相比降低，且其高表达患者中位生存期较低表达患者延长。hSulf-1的表达水平与肝癌患者的生存预后密切相关。
　　 3.hSulf-1在肝癌的发生、发展过程中可能起重要作用。有望成为肝癌治疗的新靶点。