NOTCH-1在主动脉瓣二叶畸形合并主升主动脉扩张发生中的作用机制研究

摘要

研究背景与目的:
　　 主动脉瓣二叶畸形(BicuspidAorticValve，BAV)是常见的先天性心脏畸形，在普通人群中的发病率大约在0.46％-1.37％，男女比率约为3:1。BAV患者可终身没有症状，若是合并主动脉病变如升主动脉扩张(Ascendingaorticdilation，AAD)、升主动脉瘤(Ascendingaorticaneurysm，AAA)或主动脉夹层(Aorticdissection，AD)，则手术治疗风险和治疗费用显著增加，术后并发症发生率和死亡率增高。因此探讨BAV合并AAD的发生机制，不仪对疾病的早期诊断、早期治疗提供指导，还可以为今后BAV合并AAD的生物治疗提供潜在靶点。
　　 目前普遍认为，主动脉血管中层平滑肌细胞(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)的功能异常与主动脉病变的发生密切相关。VSMC是血管中层的主要细胞类型，现有研究表明VSMC凋亡、表型转化和高分泌MMPs导致动脉血管结构破坏，细胞迁移增加和细胞外基质降低，最终导致AAD发生。但是，对于VSMC功能异常的机制仍不明确，尤其是BAV合并AAD的具体机制目前未见报道。
　　 NOTCH信号通路是人体内高度保守的跨膜信号传导通路，其在调控细胞增殖、分化和凋亡的过程中发挥重要作用。淋巴瘤、胶质瘤、非小细胞癌和胰腺癌等肿瘤细胞的凋亡与NOTCH-1基因相关，当NOTCH-1下调时，肿瘤细胞的凋亡增加，这也成为许多肿瘤治疗的研究靶点。现有研究发现，在胚胎心脏发育过程中，NOTCH-1在调控内皮细胞向间叶细胞转化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)中发挥重要作用，而EMT是胚胎期瓣膜发育的重要环节。已有研究表明，NOTCH-1基因异常导致信号传导障碍不仅导致BAV的发生，而且与远期瓣膜钙盐沉积及钙化相关。但是NOTCH-1基因的表达改变是否也调控VSMC的功能从而影响主动脉壁功能以及其中的可能机制目前尚未见报道。
　　 本实验旨在通过回顾本院近20年入院手术BAV患者的临床资料，总结BAV发病的流行病学特点，分析其合并症特别是AAD的临床特点，研究引起AAD的高危因素，为今后的临床诊治提供依据。在此基础上，以临床病理及组织标本为切入点，分析BAV合并AAD的分子病理学特征，了解NOTCH-1基因在BAV合并AAD发病中的作用，并在细胞学水平验证NOTCH-1基因改变与血管平滑肌细胞功能改变的联系，提出其可能的分子机制，为BAV合并AAD的预防与治疗提供理论支持。
　　 研究方法和结果:
　　 为以上目的，本研究分为以下四个部分：
　　 1、分析总结20年在院手术治疗的BAV患者的临床资料，包括患者性别、年龄、体表面积(BSA)、术前合并症、心功能等级，以及术前重要的超声检查指标，根据瓣膜解剖特点确定分型。分析不同性别及不同瓣膜分型在临床特点、合并症方面有无差异。并在此基础上，采用二元Logistic回归分析对升主动脉扩张的危险因素进行分析，得出BAV合并AAD的危险因素。
　　 统计结果显示，BAV患者以男性占多数，主要的临床合并症包括瓣膜功能障碍、感染性心内膜炎和升主动脉病变等。最为常见合并的先天性心脏病为主动脉缩窄和室间隔缺损。在瓣膜分型中，以左-右冠瓣融合型(L-R型)最为常见，占63.3％，其次为右-无冠瓣融合型(R-N型)，占32.8％。全组406例患者在院死亡率为6.2％，要高于同期其他在院因主动脉瓣病变手术患者，合并感染性心内膜炎是导致在院死亡率增大因素之一。性别差异影响到BAV患者的临床特点，入院手术时男性患者的年龄明显低于女性患者，并且男性患者更易合并有SBE。男性患者表现出更差的心脏功能，而女性患者则更常表现出合并有升主动脉病变。不同瓣膜分型在临床特点上也有差异：L-R型患者易同时累及升主动脉，而对于R-N型患者，瓣膜功能障碍更易出现。通过Logistic回归分析，我们发现年龄增加和女性是BAV合并AAD的独立危险因素。
　　 2、通过分析BAV患者升主动脉标本的病理标本，总结其组织学特征和细胞外基质成分的分子生物学改变，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnickendlabelingassay，TUNEL)染色法检测BAV组和TAV组与正常对照组中主动脉壁中层细胞凋亡率的差异。免疫组化分析基质金属蛋白酶-2，9(Matrixmetalloproteinase，MMP)的表达情况，并采用qRT-PCR检测标本中的NOTCH-1、VSMC分化迁移标志蛋白在分子水平表达情况。最后，根据NOTCH-1的表达情况，将BAV合并AAD组分成NOTCH-1表达正常组和低表达组，分别比较两组间细胞凋亡率、MMP-2，9及VSMC分化标志蛋白的表达差异。
　　 经过研究，我们发现，相比于正常对照组，BAV合并AAD患者的主动脉壁结构破坏、平滑肌细胞的丢失增多。维多利亚蓝染色(Victoriablue，VB)显示BAV主动脉壁中的红色胶原纤维含量增高而蓝色的弹力纤维断裂、含量降低。免疫组化结果可见BAV和TAV合并AAD患者的MMP-2，9表达显著高于正常对照组。TUNEL染色见正常主动脉壁中仅有少量凋亡细胞，而在BAV合并AAD组和TAV合并AAD中，凋亡明显增多，并且主动脉扩张程度越重，中层VSMC凋亡越多。qRT-PCR检测提示，NOTCH-1基因在BAV/N组和BAV/AAD组中明显低于对照组(P<0.01)，在TAV/AAD组中低于对照组(P<0.05)。代表活化收缩型VSMC的a-SMA和SM22a的表达明显降低，而调节细胞外基质成分代谢的MMP-2，9则明显上调。我们还发现，NOTCH-1表达下调与VSMC凋亡及表型转化相关。相比与NOTCH-1正常组，在NOTCH-1下调组中，平滑肌细胞凋亡率显著增高，a-SMA和SM22a的表达显著降低，但MMP-2，9的表达无统计学差异。
　　 3、为了研究BAV相关的目的基因。NOTCH-1在调控VSMC凋亡中的作用机制，我们首先通过体外成功培养可用于细胞学实验的VSMC，并采用化学合成法构建NOTCH-1的siRNA，通过脂质体转染成功下调NOTCH-1表达。在此基础上我们通过Annexin-V/PI双标记流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化，并通过qRT-PCR和Westernblot分别检测凋亡相关蛋白在mRNA水平和蛋白水平的变化，从不同凋亡通路分析其参与的可能性，从而得出NOTCH-1调控VSMC凋亡的主要机制。
　　 实验结果显示，相比siRNA阴性对照组，NOTCH-1siRNA转染组细胞凋亡率显著提高，凋亡相关的蛋白也有相应的变化。siRNA实验组的促凋亡蛋白Caspase-9和Bax显著提高，而抑制凋亡蛋白BCL-2及NF-KappaB显著降低；另一方面Caspase-8的表达也有升高，但不如其他凋亡蛋白的表达变化程度大。因此，我们认为，NOTCH-1调控VSMC凋亡主要通过线粒体途径完成，但也不排除受体介导途径在其中的作用。
　　 4、我们在体外培养大鼠VSMC及转染NOTCH-1siRNA的基础上，采用qRT-PCR和Westernblot方法检测NOTCH-1siRNA组和阴性转染组间VSMC表型转化标志基因a-SMA和SM22a的表达差异，分析NOTCH-1基因下调对VSMC分化的影响。利用Transwell迁移实验研究分析VSMC迁移能力的变化，同时检测MMP-2，9的表达情况，分析MMPs表达受NOTCH-1下调的影响及其对VSMC迁移能力的影响。
　　 通过研究我们发现，NOTCH-1下调后可诱导VSMC由收缩亚型向合成亚型转化，a-SMA和SM22a的表达在siRNA组中显著下降。伴随着NOTCH-1表达下调，VSMC细胞迁移能力增加，但影响细胞迁移能力的MMP-2，9并无显著上升，提示NOTCH-1调控VSMC迁移能力改变主要是通过改变细胞的分化状态而不是通过影响MMPs的表达，NOTCH-1对MMP-2，9的表达无直接的调控作用。
　　 结论:
　　 1、BAV患者男女比例约为2.6:1，最常见的合并症有瓣膜功能异常、感染性心内膜炎(12.5％)，升主动脉扩张(44.1％)。伴发最常见的先天性心脏病为主动脉缩窄和室间隔缺损。在二叶瓣分型中最常见的是L-R融合型(占63.3％)，其次为R-N融合型(占32.8％)；
　　 2、男性BAV患者更易发生AI，且易并发感染性心内膜炎；而女性患者更易发生AS。女性患者更加容易并发升主动脉扩张。L-R型BAV患者易并发升主动脉扩张和主动脉窦部扩张，并且更易出现AI，而R-N型患者更易发展成为AS合并AI；
　　 3、影响BAV患者合并升主动脉的独立危险因素包括年龄增加和女性，因合并感染性心内膜炎而早期就诊是起到一定保护性作用；
　　 4、BAV合并AAD的基本组织病理改变是中层囊性坏死，包括平滑肌细胞肿胀、变性、缺失，弹力蛋白断裂、消失，且病理改变的严重程度与主动脉扩张的程度存在一定的关联；
　　 5、NOTCH-1表达下调、VSMC的凋亡增加及表型转化、MMP-2，9的表达与BAV合并AAD的发生具有相关性；
　　 6、NOTCH-1的表达下调与VSMC凋亡增加、表型转化具有相关性；
　　 7、NOTCH-1表达下调可促进VSMC凋亡增加，线粒体凋亡通路的相关蛋白表达有显著差异提示其发挥了重要作用，但不排除受体介导通路在其中发挥的作用。
　　 8、NOTCH-1表达下调可诱导VSMC由收缩型向合成型转化，收缩型VSMC的标志蛋白a-SMA和SM22A表达下调；
　　 9、NOTCH-1对MMP-2，9的表达没有直接调控作用，NOTCH-1表达下调时，MMP-2，9表达变化无明显差异；
　　 10、NOTCH-1表达下调可促进VSMC迁移力增加，与细胞表型转化相关，而与MMP-2，9的表达无直接联系。