miRNA-100在膀胱尿路上皮癌发生发展中的抑制作用及机制研究

摘要

[背景]：
　　 膀胱癌是我国发病率最高的泌尿系统肿瘤，是一种直接威胁患者生存的疾病。世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十位之后。男女患病率约为3:1。据统计，2011年世界膀胱癌新发病例数达到69250例，因患膀胱癌死亡人数居总体因肿瘤死亡人数的第8位。大约90％的膀胱癌属上皮细胞源性的，且绝大部分为尿路上皮细胞癌。膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌(Tis，Ta，T1)和肌层浸润性膀胱癌(T2以上)。非肌层浸润性膀胱癌具有多相群的特点，包括了从良性的肿瘤，到极少发生进展的非浸润性的乳头状瘤，以及到乳头状生长的侵袭粘膜下层的肿瘤，该类型可有多达60％的进展率。膀胱癌的肿瘤分级也是一个重要的预后相关因子。低级别的分化良好，高级别的分化差、容易进展。目前，对膀胱癌发生发展的机制尚未充分的阐明。为了探寻更好的膀胱癌诊断和治疗的有效方法，有必要进一步研究其发病机制。
　　 microRNA(miRNA)是一类小RNA(约20-22个碱基)，它们通过与靶信使RNA(mRNA)的碱基互补，根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。迄今为止，人类基因组中发现了1527个miRNA((http://www.mirbase.org/)，据预测，miRNA可能调控人类所有的基因翻译。近年来研究证实人类microRNA是肿瘤状态的发展与维持中的重要因子，它们存在于肿瘤相关基因组区域，扮演者肿瘤抑癌基因或癌基因的角色。膀胱肿瘤的发生机制研究中，microRNA水平的研究近年也渐有文献报道，如miR-125b，-133a，-143，-218和-221等，这些miRNA都和膀胱癌的发生发展相关。但这些报道依然缺乏良好的系统性和一致性。如今，如果能利用基因芯片技术进行高通量筛选，进一步研究明确miRNA在膀胱癌疾病进展中的基因调节体系，建立与膀胱肿瘤进展高度相关的miRNAs系列簇，无疑对膀胱癌的预测、早期诊断、及时治疗、实现基因治疗和术后预后判断提供很好的理论依据和实现新的治疗技术革新。
　　 最近报道提示miR-100在低级别的膀胱癌组织中表达下调，然而，它的生物学功能未见深入的研究和探索。同时，在针对其他肿瘤的研究中，miR-100的功能特点存在较大的差异，其在急性髓性白血病中是癌基因，而在宫颈癌中则是抑癌基因。本研究是在前期实施miRNA芯片预实验行膀胱癌组织miRNA表达差异高通量筛选的基础上，发现miR-100在各个分期和分级的膀胱癌组织中是低表达的。我们将重点探索miR-100在在膀胱尿路上皮癌发生发展中的抑制作用及机制。
　　 [目的]：
　　 探讨miR-100在膀胱尿路上皮癌发生发展中的抑制作用及机制，为miR-100成为膀胱癌预后判断和治疗靶点奠定理论基础。
　　 [材料和方法]：
　　 1.组织样本和细胞株的准备。共收集膀胱癌成对组织样本77例，9个膀胱癌细胞株及建立1株原代膀胱癌细胞系。
　　 2.microRNA芯片实验。选用10例膀胱癌样本，实施20张miRNA芯片实验。
　　 3.利用Realtime-PCR技术，对miRNA芯片实验得到的差异microRNA在扩大样本量膀胱癌样本中进行验证，比较分析，明确稳定且表达差异显著的3-4个microRNA。结合文献参考、分析归纳，确认下一步研究miR-100。
　　 4.质粒构建、慢病毒包装和转染。miR-100前体模拟物、抑制体及对照RNA的合成。
　　 5.miR-100过表达或抑制后细胞表型的变化。包括细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的相关实验。
　　 6.运用流式细胞技术检测细胞生长变化中细胞周期和凋亡情况变化。
　　 7.裸鼠膀胱癌成瘤模型的建立和验证实验。采用皮下种植膀胱癌EJ细胞，膀胱内原位种植膀胱癌5637细胞两种体内实验模型。
　　 8.原代膀胱癌细胞株和裸鼠膀胱癌转移模型的建立和验证。建立一株浸润性强的膀胱原代细胞921T，并运用该细胞成功构建裸鼠膀胱癌转移模型，验证miR-100及其靶基因与肿瘤浸润转移的相关性。
　　 9.生物信息学分析研究，行GO分析和Pathway分析，构建miR-target-network，寻找miR-100的直接靶基因。
　　 10.qRT-PCR、双荧光素酶报告基因检测、WesternBlot靶基因实验验证。
　　 11.统计学分析。
　　 [结果]：
　　 1.分析芯片实验数据表明，20个miRNA在非肌层浸润性的膀胱癌组织中存在明显差异表达，而22个在肌层浸润性癌中明显差异表达。二者有10个miRNA的交集。扩大样本67例行qRT-PCR实验验证，发现miR-100和-145在癌中稳定下调而miR-182则稳定上调。其中miR-100表现最为明显。
　　 2.体外和体内实验均表明，miR-100能抑制膀胱癌细胞的增殖。CCK-8检测法和克隆形成实验均提示，miR-100的过表达能抑制体外细胞的增殖能力，而抑制胞内miR-100的水平则促进细胞的生长。该现象在皮下种植和膀胱原位种植受慢病毒Lenti-miR-100侵染的膀胱癌EJ/5637细胞成瘤生长实验中得到验证。
　　 3.mTOR是miR-100的直接靶基因。生物信息学手段提示mTOR是miR-100的直接靶点之一。双荧光素酶报告基因实验检测证实miR-100能直接结合于mTOR的3’UTR区。二者在9个膀胱癌细胞系的表达差异呈现负相关。Westernblot和qRT-PCR实验验证miR-100的过表达能在mRNA和蛋白水平抑制mTOR的表达。
　　 4.miR-100能起到类似于si-mTOR的作用，其过表达能使EJ或5637细胞周期产生G1期阻滞，而未有凋亡能力的改变；同时，慢病毒Lenti-miR-100侵染后的5637细胞能对化学药物阿霉素更加敏感。
　　 5.miR-100过表达和si-mTOR均能抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。
　　 6.肿瘤转移模型成功构建，分析膀胱癌转移灶和原发灶组织的miR-100和mTOR及其下游基因p70S6K的表达情况，相对于原位的膀胱肿瘤，远处转移灶组织中miR-100的表达水平更低，而mTOR则上调。
　　 [结论]：
　　 1.miR-100在膀胱癌组织中普遍低表达。提示该基因为膀胱癌的抑癌基因，且在各个分期或分级的膀胱癌中均能稳定下调。
　　 2.调节miR-100在膀胱癌细胞内的表达水平能相应改变膀胱癌细胞恶性表型，包括：过表达能抑制EJ、5637细胞进入S期而降低细胞的增殖能力；抑制细胞的迁移、侵袭能力；减弱EJ、5637细胞体内成瘤能力。而抑制该基因的表达则能促进细胞的增殖、侵袭能表型变化。结果提示miR-100的表达与膀胱癌细胞的活性负相关，有望成为膀胱癌基因治疗的有效分子。
　　 3.mTOR基因及其所在信号通路是目前肿瘤病理机制研究的热点，而我们发现该基因恰是miR-100的直接靶点之一。充分实验证实，miR-100的过表达能抑制mTOR的表达水平。Si-mTOR介导的mTOR表达沉默能有相似的细胞表型变化。表明miR-100可能通过mTOR信号通路作用，影响细胞的生长。
　　 4.膀胱癌裸鼠远处转移模型的研究成果提示miR-100可能作为膀胱癌远处转移、预后的预测因子和潜在的治疗靶点。该结果值得后续临床样本进一步验证和总结。
　　 总之，miR-100参与膀胱癌的发生、发展，是膀胱癌疾病发生和进展的重要调节因子之一，其表达的恢复有利于膀胱癌细胞恶性表型的控制和阻抑；同时，miRNA-100直接调控靶基因mTOR，作用于mTOR信号通路，该通路对细胞的生长、周期调节、细胞增殖和能动性等密切相关。所以，miR-100有望成为膀胱癌诊断、预后判断的新因子和治疗的新工具。