肺癌细胞株A549对不同浓度阿霉素应答机制的探讨

摘要

癌症是威胁人类健康的一大难题，据预测，到2020年，全球每年癌症新发病人数将达到1500万。目前，世界上癌症发病率以肺癌居首，依次为肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌等；我国的情况则是肺癌、胃癌、肝癌发病率排名前三。由于癌症病死率高，发病率又与日俱增，所以越来越受到人们的重视。
　　 现在，癌症的治疗策略主要为手术和化疗为主。化疗药物在临床治疗中广泛使用，但是无一例外的，都受到机体耐药性的产生以及药物自身的毒副作用严重制约，所以如何提高化疗药物的治疗效益是很多临床和科研工作者希望解决的问题。化疗药物种类繁多，阿霉素(adriamycm又称doxorubicinhydrochloride)就是其中一种经典抗生素类广谱抗肿瘤化疗药物，它在急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌及多种其他实体肿瘤均有治疗作用；其抗肿瘤作用机制是不仅可直接杀伤肿瘤细胞，致细胞变性坏死；也可影响拓扑异构酶Ⅱ的活性抑制DNA的合成，影响细胞周期；或者损伤DNA(damageDNA)，启动内源和外源信号抑制RNA合成，对细胞凋亡产生影响。近年，通过阿霉素对外周感觉神经节细胞毒性的研究，突破了阿霉素作为抗肿瘤药物的传统观念，合理应用阿霉素可以治疗难治性神经痛。
　　 Survivin基因是一个细胞凋亡抑制基因，其表达蛋白作为细胞凋亡蛋白抑制物(inhibitor-ofapoptosisprotein，IAP)家族新成员，可通过抑制凋亡终末效应酶Caspase-3活性或与周期蛋白激酶CDK4，CDK2相互作用阻断凋亡信号通路参与细胞凋亡，影响细胞周期。survivin基因的表达具有肿瘤特异性，表达于肿瘤及胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖和浸润转移密切相关。
　　 NF-κB通路作为一条与炎症关系较为密切的信号通路，在细胞凋亡中发挥着重要的调控作用。作为一个转录因子，它可以调控200多个基因的表达。它的活化对细胞的抗凋亡与凋亡起着双重作用。Caspase3是细胞Caspase级联反应中重要的一个环节，无论细胞外源性信号途径激活Caspase8，或者内源性信号途径激活Caspase12，还是内质网途径激活Caspase9，最终都将激活Caspase3进一步作用于下游分子，导致细胞凋亡。
　　 基于上述研究背景，我们在前期的研究工作观察到阿霉素对肺癌细胞株A549的增殖抑制作用中出现双重效应，也即阿霉素药物浓度逐渐升高，细胞增殖抑制效应随之增强，但当药物浓度达5μg/ml时随着浓度继续增加增殖抑制效应却出现减弱趋势，这将对我们今后在阿霉素临床应用以及新药效研究上有什么启示?希望通过本课题就这现象产生的机制研究得到可能的答案。
　　 第一部分，阿霉素对肺癌细胞株A549增殖抑制的双重效应
　　 阿霉素是一种经典抗生素类广谱抗肿瘤化疗药物，对多种肿瘤具有抑制增长的效应，在临床与科研实验中都有比较广泛的应用，且在各个环境下使用浓度也有所不同。至于不同药物浓度作用下，阿霉素抑制肿瘤细胞的机理是否完全一致迄今未见有关报道，尚需进一步探讨。在本部分研究中，我们主要采用了细胞增殖抑制实验，也即MTT实验检测不同浓度阿霉素干预处理肺癌细胞株A549后的细胞增殖抑制。
　　 结果表明，以不同浓度阿霉素(0.1、0.2、0.5、1、2、5、12.5、25、50和100μg/ml)分别干预处理肺癌细胞株A549，时间24小时，通过MTT实验检测到的各浓度对细胞增殖抑制率相比较空白对照组都具有显著差异，其中IC50值为1μg/ml。根据统计学单因素方差分析，发现药物浓度在5μg/ml以下，随浓度升高细胞增殖抑制率也增高，组间差异明显(P<0.05)，在浓度为5μg/ml时达最高值；药物浓度在5μg/ml以上，随浓度继续升高细胞增殖抑制率随之出现下降趋势，分别与浓度5μg/ml组比较差异有统计学意义(P<0.05)。这种阿霉素对肺癌细胞株A549增殖抑制双重性效应产生的机制，尤其是否对阿霉素在临床使用或新药效研究中有重要价值，未见报道。为进一步明确出现这种细胞增殖抑制双重性现象不是由于细胞在阿霉素药物作用下的变性坏死所为，我们选择了5个具有显著差异的浓度组；0.1、0.5、1、5和50μg/ml，其抑制率分别为11.1％、33.4％、48.5％、71.9％和57.5％，药物浓度分布在出现细胞增殖抑制率最高值浓度5μg/ml的两侧。采用LDH释放实验检测细胞变性坏死后LDH的释放，结果发现在各药物浓度干预作用下LDH释放水平基本一致，无统计学差异。又经多次重复实验结果基本一致，因此我们可以认为，阿霉素对肺癌细胞株A549增殖抑制双重效应可能是通过对细胞周期或细胞凋亡的调控失衡所致，阐明其发生机制可能对阿霉素临床使用或新药效研究有一定启迪。
　　 第二部分，survivin和caspase3可能参与了这个双重效应
　　 Survivin基因作为细胞凋亡抑制基因，其表达产物survivin蛋白对细胞的存活有着重要意义。survivin基因的表达具有肿瘤特异性，其表达于肿瘤及胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖和浸润转移密切相关；在细胞处于G0/G1期时，其表达是上调的，可能起到抗细胞凋亡作用。细胞在接受阿霉素干预处理后，会发生DNA损伤，启动内源性和外源性信号，启动细胞的凋亡以及抗凋亡途径，caspase3作为细胞凋亡终未效应酶，可能参与其中。为证实survivin基因表达与阿霉素呈现的细胞增殖抑制双重效应相关，本部分实验选择抗细胞凋亡基因survivin、促细胞凋亡基因Bax以及细胞凋亡过程中的终未效应酶Caspase3分子，采用实时定量RT-PCR检测其mRNA在不同浓度阿霉素干预处理肺癌细胞株A549后的表达水平。
　　 肺癌细胞株A549在选择的5个不同浓度阿霉素(0.1、0.5、1、5和50μg/ml)干预处理24小时后，survivin基因mRNA表达的实时定量PCR相对值分别为0.71、0.32、0.84、1.11和5.73，可见在药物浓度达50μg/ml时，该值显著增加，伴随caspase3基因的表达在同样药物浓度时实时定量PCR值结果为2.09、6.23、14.70、4.17和0.21，在药物浓度达到50μg/ml时该值却显著下降。survivin与caspase3在不同浓度阿霉素干预处理8小时后，呈现出相反的变化趋势。这帮助我们解释了阿霉素药物浓度在高于5μg/ml时，由于细胞凋亡抑制基因survivin的表达水平大幅度上调，肺癌细胞株A549的增殖抑制率却出现下降这一现象；同时也告之细胞凋亡参与阿霉素抗肿瘤作用。
　　 第三部分，细胞周期阻滞与这个双重效应可能相关
　　 研究报道survivin基因作为细胞凋亡抑制基因具有抗凋亡功能，其表达上调与细胞周期阻滞相关，但是survivin基因介导的细胞周期抑制作用是否参与阿霉素对肺癌细胞株A549增殖抑制效应尚未见报道。为此，本部分实验旨在进一步证实，并探讨其可能作用的细胞周期调控分子。本部分通过对5个实验组(药物浓度0.1、0.5、1、5和50μg/ml)作用细胞24小时后，western检测其蛋白表达水平与survivin基因表达水平是否一致。通过流式细胞技术分析其细胞周期的变化，并且对周期阻滞蛋白P21表达的检测，进一步说明细胞周期是否对细胞增殖抑制产生影响。以及用羟基脲抑制细胞周期至G1期后再进行阿霉索处理，观察细胞生长抑制状况。
　　 研究结果表明，survivin蛋自在高浓度药物作用下表达量明显升高，与基因表达水平一致。从细胞周期检测可以看到，药物刺激组细胞表达基本阻滞在G1/S期以前，G1期细胞相对比例为(1.01、0.88、0.61、0.84、0.96)并且浓度1μg/ml组为最低值，高浓度组(50μg/ml)G1期细胞比例上升。进一步对P21的western检测发现，药物刺激组的P21表达水平都有显著升高。说明在阿霉素作用后，A549细胞株发生了细胞周期阻滞，细胞停留在G1/S，伴随survivin基因的高表达，这种表达可能与G0/G1期细胞数目关系更为密切(线型一致)。进一步使用羟基脲将细胞周期阻滞于G1期后，再用阿霉素进行刺激，发现阿霉素整体作用效能下降，细胞各浓度组间差异不明显。提示高浓度阿霉素作用于A549后，细胞发生周期阻滞于G1期，通过高表达的survivin促进了细胞的存活。
　　 第四部分，细胞凋亡水平变化可能参与了此双重效应
　　 阿霉素刺激细胞，导致DNA损伤，不可避免的带来凋亡信号。与细胞增殖、凋亡相关信号通路有很多，NF-κB作为其中的一条炎症信号通路，参与细胞凋亡与抗凋亡的发生。本部分通过AnnexinV流式检测观察细胞凋亡早晚期情况以及westernblotting检测caspase3蛋白表达情况和NF-κB激活状态说明细胞凋亡水平与此双重效应相关
　　 通过流式观察5个处理组随着浓度的升高，处于凋亡期的细胞比例分别为(7.5％(对照组)、13％、12.1％、14.7％、32.2％、18％)，说明在高浓度情况下(50μg/ml)，处于凋亡期的细胞确实相对减少。’Western检测activatecaspase3在高浓度组(50μg/ml)无表达，低浓度组(0.5μg/ml)有表达，与基因水平一致，进一步证实了与细胞凋亡相关。进一步通过对磷酸化P65蛋白的检测，我们可以看到，在阿霉素作用下，高浓度组(50μg/ml)和低浓度组(0.5μg/ml)，其磷酸化p65表达水平在2h增加，后激活下降，继而到12小时左右，细胞磷酸化P65蛋白再次升高，提示在阿霉素作用的情况下，NF-κB信号通路产生了二次激活，NF-κB可以通过上调抗凋亡因子发挥作用，可能与细胞凋亡抑制相关。