抗LAG-3抗体对脓毒症小鼠保护作用及免疫功能影响的研究

摘要

目的:
　　 脓毒症(sepsis)是指由于创伤、感染等一系列因素引起机体过激的炎症反应和免疫应答，继而对机体产生严重危害的疾病，其病死率一直居高不下。脓毒症病理生理过程中免疫系统的功能抑制是其中的一个非常突出问题，并已经成为脓毒症病死率居高不下以及各种治疗效果不佳的重要原因。而在导致免疫抑制的各种原因中，淋巴细胞的凋亡以及功能障碍是一个重要的原因，但是其具体发生机制目前尚未完全清楚。
　　 淋巴细胞活化基因-3分子(lymphocyteactivationgene3，LAG-3，CD223)是免疫球蛋白超家族的一员，可负性调节免疫细胞的各项功能和生存周期。已有研究表明，LAG-3在病毒感染、自身免疫疾病以及肿瘤所致的免疫系统功能紊乱中发挥着重要作用，通过影响LAG-3的功能可以改善这些疾病演进过程中免疫功能失常状态，从而改善疾病的预后。
　　 LAG-3分子在脓毒症免疫抑制中扮演何种作用，干预LAG-3分子能否影响脓毒症的预后和免疫系统功能尚未见报道。为此，本实验旨在研究盲肠结扎穿孔(cecalligationandpuncture，CLP)脓毒症后LAG-3分子在小鼠不同免疫细胞上的表达变化；并探索应用抗LAG-3抗体治疗后，是否对脓毒症小鼠产生保护作用，是否会影响淋巴细胞凋亡及功能，并以此探求其在脓毒症免疫抑制中的作用，以及脓毒症免疫治疗合理可靠的治疗靶点。
　　 方法:
　　 1、采用CLP术致脓毒症小鼠模型。将24只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(n=10)和CLP组(n=14)，手术24h后流式细胞仪检测CLP组和假手术组小鼠外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞、脾脏CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(regulatoryTcells，Treg)、树突状细胞(dendriticcell，DC)上的LAG-3表达水平。
　　 2、将81只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham，n=9)、CLP组(CLP，n=16)、CLP+腹腔注射抗LAG-3抗体组(i.p.Anti-LAG-3，n=16)、CLP+腹腔注射同型对照抗体组(i.p.Isotype，n=12)、CLP+尾静脉注射抗LAG-3抗体组(i.v.Anti-LAG-3，n=16)和CLP+尾静脉注射同型对照抗体组(i.v.Isotype，n=12)，手术后3h给予抗LAG-3抗体或同型对照抗体(均每只50μg/200μl)，观察抗体干预后小鼠10d生存率及生存时间。
　　 3、将55只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham，n=7)、CLP组(CLP，n=18)、抗LAG-3抗体组(Anti-LAG-3，n=18)、同型对照抗体组(Isotype，n=12)，除假手术组外其余小鼠均行CLP术，并于手术后3h按分组分别经腹腔给予抗LAG-3抗体或同型对照抗体(均每只50μg/200μl)。24h后取各组小鼠肺组织、外周血及腹腔冲洗液，检测肺组织湿重/干重比值，血液及腹腔冲洗液细菌负荷，以及血浆TNF-α、IL-6和IL-10水平。
　　 4、将33只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham，n=8)、CLP组(CLP，n=9)、抗LAG-3抗体组(Anti-LAG-3，n=9)、同型对照抗体组(Isotype，n=7)，除假手术组外其余小鼠均行CLP术，并于手术后3h按分组分别经腹腔给予抗LAG-3抗体或同型对照抗体(均每只50μg/200μl)。24h后取各组小鼠外周血、脾脏及胸腺，采用流式细胞仪检测各组小鼠外周血及脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞细胞计数，同时检测小鼠胸腺T淋巴细胞凋亡情况。另取同样分组及同样处理的18只C57BL/6小鼠脾脏及胸腺，采用TUNEL法检测其凋亡情况。
　　 5、取CLP术后18h小鼠脾脏，采用密度梯度法分离小鼠脾脏淋巴细胞，之后将分离得到的细胞分为两部分，每部分设立对照组(Control)、抗LAG-3抗体组(Anti-LAG-3)和同型对照抗体组(Isotype)。一部分以抗CD3/抗CD28抗体培养诱导细胞凋亡，72h后收集细胞检测；另一部分用重组小鼠TNF-α培养诱导细胞凋亡，18h后收集细胞检测。均采用流式细胞仪检测各组CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的凋亡情况。
　　 6、取CLP术后18h小鼠脾脏，采用密度梯度法分离小鼠脾脏淋巴细胞，之后将分离得到的细胞分为对照组(Control)、抗LAG-3抗体组(Anti-LAG-3)和同型对照抗体组(Isotype)，先以抗CD3/抗CD28诱导刺激细胞生长67h，再采用PMA、离子霉素和BFA共同刺激细胞分泌细胞因子5h，之后收集细胞，并采用流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞细胞内分泌IFN-γ的水平。
　　 7、取CLP术后18h小鼠脾脏，采用密度梯度法分离小鼠脾脏淋巴细胞，之后将分离得到的细胞分为对照组(Control)、抗LAG-3抗体组(Anti-LAG-3)和同型对照抗体组(Isotype)，先用CFSE标记细胞，后加入抗CD3/抗CD28抗体培养刺激细胞增殖，5d后收集细胞，采用流式细胞仪检测各组CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的增殖情况。
　　 结果:
　　 1、CLP术后24h时，脓毒症小鼠外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD19+B细胞和NK细胞表面LAG-3表达较假手术组均非常显著升高(P均小于0.01)；脾脏CD4+CD25+Treg、DC的表面的LAG-3表达较假手术组也均非常显著升高(P均小于0.01)。
　　 2、CLP术后3h给予抗LAG-3抗体，i.p.Anti-LAG-3组和i.v.Anti-LAG-3组小鼠生存率及生存时间显著高于CLP组、i.P.Isotype组和i.v.Isotype组(P均小于0.05)。而i.p.Anti-LAG-3组和i.v.Anti-LAG-3组之间，以及i.p.Isotype组和i.v。Isotype组之间均差异无统计学意义(P均大予0.05)。
　　 3、体内研究结果表明，Anti-LAG-3组小鼠肺组织湿重/干重比值显著低于CLP组及Isotype组(P均小于0.01)。此外，培养Anti-LAG-3组小鼠血液和腹腔灌洗液，其细菌菌落数均显著低于CLP组及Isotype组(P均小于0.01)。促炎细胞因子TNF-α、IL-6还是抗炎细胞因子IL-10,Anti-LAG-3组均显著低于CLP组及Isotype组(P均小于0.01)。
　　 4、体内研究结果表明，Anti-LAG-3组小鼠外周血及脾脏CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞计数均显著高于CLP组和Isotype组(P均小于0.05)。Anti-LAG-3组小鼠胸腺CD3+细胞及CD3-细胞凋亡比例均显著低于CLP组及Isotype组(P均小于0.05)。TUNEL结果显示，Anti-LAG-3组小鼠胸腺及脾脏组织中TUNEL染色阳性的细胞比例均显著低于CLP组和Isotype组(P均小于0.01)。
　　 5、体外抗CD3/抗CD28抗体诱导CLP小鼠脾脏淋巴细胞凋亡后显示，Anti-LAG-3组CD4+T细胞、CD8+T细胞凋亡比例显著低于Control组和Isotype组(P均小于0.01)。而采用TNF-α诱导凋亡后CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞凋亡比例无差异(P均大于0.05)。
　　 6、体外刺激CLP小鼠脾脏淋巴细胞后显示，Anti-LAG-3组IFN-γ+的CD4+T淋巴细胞比例显著高于Control组及Isotype组(P均小于0.01)。而各组IFN-γ+的CD8+T淋巴细胞比例差异无统计学意义(P均大于0.05)。
　　 7、体外检测CLP小鼠脾脏淋巴细胞的增殖情况表明，Anti-LAG-3组CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞增殖比例均明显高于Control组及Isotype组(P均小于0.01)。
　　 结论:
　　 CLP致脓毒症小鼠外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞、NK细胞、脾脏Treg细胞、DC上的LAG-3表达水平均明显升高。应用抗LAG-3抗体之后，可以明显延长CLP小鼠的生存率和生存时间，且无论经腹腔还是经静脉用药均有效，两种给药方式之间无差异。在体应用抗LAG-3抗体之后，对CLP小鼠起到了明显的保护作用，表现在肺组织湿重/干重比值降低，血液和腹腔细菌负荷明显减轻，血浆促炎和抗炎细胞因子水平下降。在免疫细胞功能方面，本研究结果提示：①在体应用抗LAG-3抗体后CLP脓毒症小鼠外周血和脾脏CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞，胸腺各发育阶段细胞凋亡均有明显减少，TUNEL结果也提示CLP脓毒症小鼠胸腺和脾脏凋亡情况有所减轻；②体外研究结果提示，抗LAG-3抗体主要参与保护了T淋巴细胞受体(Tcellreceptor，TCR)途径而非TNF-α-TNFR途径诱导的T淋巴细胞凋亡；③体外应用抗LAG-3抗体后，抗LAG-3抗体可以促进CD4+T淋巴细胞分泌WN-γ，向具有促进细胞免疫效应的1型辅助性T细胞(Thelpercell1，Th1)方向分化，但对CD8+T淋巴细胞分泌促炎细胞因子方面无明显改善作用；④体外应用抗LAG-3抗体后，CD4+和CD8+T淋巴细胞的增殖情况均有明显改善，提示抗LAG-3抗体还可以通过促进增殖来改善脓毒症后小鼠T淋巴细胞功能抑制，调节免疫功能。