孔壁表现纳米化的nHA晶须增强多孔骨支架的制备与性能研究

摘要

在现代医学中，由于创伤、感染、骨肿瘤切除和骨髓炎等原因导致的大段骨缺损是骨科临床上常遇到的问题，而如何去修复骨缺损以恢复骨骼的完整和功能一直是困扰骨科医生的难题。目前临床上对于骨缺损的修复主要是通过自体骨(髂骨、肋骨)移植来完成的，但自体骨存在来源局限，且易造成神经及血管损伤，只能用于短节段骨缺损；通过同种异体骨移植来修复骨缺损是近几年临床常采用的方法，但异体骨移植存在免疫排斥等问题，易被自体骨排斥而造成骨不愈合，因此造成现代医疗技术对治愈严重骨缺损方面还存在着来源少，不易愈合等问题。骨组织工程的发展为治愈骨缺损带来了新的希望。通过对骨组织工程骨的不断研究与开发，已经制备出具有高孔隙率、良好生物性能的人工骨，并且已经在骨科、颌面外科和口腔科上得到广泛应用，取得了良好的经济价值。随着社会经济的发展，对骨组织工程材料的需求也在不断的增加。随着技术的发展，骨组织工程支架材料在制备和材料上取得了巨大的进步，但现在临床上应用的人工骨材料在骨诱导性，生物力学强度和骨解剖形态等方面还存在不足，所以，制备出一种具有良好力学性能和生物活性，且具有与自然骨相似结构的人工骨支架材料，是当前骨组织工程研究的重中之重。
　　 近年来，高孔隙率磷酸钙陶瓷的制备技术已经相当成熟，我们已经可以制备出孔隙率在97％以上的多孔支架，但是高孔隙率的提高导致支架强度降低，这一点制约了无机多孔骨支架移植材料的开发和应用。因此，如何解决孔隙率增高与强度下降之间的矛盾，制备出一种具有高孔隙率且能保持一定的力学强度，同时具有良好生物性能的支架材料，是实现骨组织工程从实验研究走向临床应用必须要面对和解决的问题。
　　 对于骨组织工程支架材料，研究最多的是无机生物陶瓷材料，其中最有代表性的是羟基磷灰石和磷酸三钙，它们与人体自然骨的无机成分相似，具有良好的骨传导性和骨诱导性；但是陶瓷材料脆性较差，在制成多孔支架后无法达到所需要力学强度，因此，必须对陶瓷材料进行增强补韧的修饰，使之能达到承重骨缺损的力学要求。通过对生物陶瓷的研究，已经研究出一些陶瓷材料增强补韧的方法，主要包括有纤维增强、晶须增强和颗粒增强等。
　　 所谓晶须其实也是纤维的一种类型，但它是以单晶形式生长，因此其直径比一半纤维小，而且不含有晶界、位错、空穴等缺陷。晶须的原子排列高度有序，使其机械强度达到邻接原子间力。因此，由于晶须具有远高于其他纤维的强度，所以常被作为增强体放入复合材料的制备过程中，用于制造出具有高强度的复合材料。其增强原理主要是靠桥接、裂纹偏转和拔出等效应来吸收断裂能量，从而消除材料尖端受到的集中应力，起到增强材料力学性能的作用。可以用来制成晶须的原料分以下几种：陶瓷、金属及高分子材料。通过在陶瓷原料中加入晶须材料可以显著提高陶瓷的强度、韧性和弹性模量，对纳米晶须生长的调控和生长机理有了初步的认知，并以用于实践，但这些研究文献中仅见于SiC/SiCw、SiCw/Si3N4、SiCw/AL2O3、莫来石等少数几个工业用陶瓷体系，而对于晶须应用于生物陶瓷及多孔基质材料的增强作用研究甚少。
　　 随着对骨生理和病理成骨机理研究的深入，我们发现自然骨是由nHA晶须和Ⅰ型胶原纤维组成的，所以，HA无机矿物质成分和结构与自然骨相类似，具有良好的生物相容性和骨诱导性，常被用来制备骨支架材料。但相对于块状HA来说，HA多孔支架的强度和韧性要比自然骨要低，目前只能用于非承重骨的骨缺损的修复上，所以，为提高陶瓷材料的强度和韧性，在本课题中我们通过将HA晶须作为增强材料加入到生物陶瓷材料中以期望能达到增强补韧的效果。
　　 综上所述，本课题拟通过在陶瓷原料中实现纳米羟基磷灰石晶须的原位生长，并通过有机模板法经过一定烧结工艺制备出纳米羟基磷灰石晶须增强多孔磷酸钙支架，而后对其进行生物力学检测和生物学检测。随后对人工骨支架孔壁表面进行纳米化修饰，并与成骨细胞复合培养，研究孔壁表面纳米化效应对成骨细胞粘附、生长、增殖的影响，并将人工骨支架移植到骨缺损模型中，以期望这种骨支架在保持高孔隙率的同时表现高强度，满足不同部位对人工骨支架的强度要求，同时孔壁表面纳米化修饰可以增加支架材料的生物性能和骨整合，起到骨缺损的填充和促进成骨，加快骨重建的作用，为其最终能应用于临床提供理论和实验支持。
　　 实验第一部分：nHAw/β-TCP复合多孔支架的制备与性能检测
　　 目的：旨在通过实验室合成原位纳米羟基磷灰石晶须增强多孔磷酸钙支架，并对其生物力学性能和生物安全性进行检测。
　　 方法：通过水热法合成原位纳米羟基磷灰石晶须，并通过泡沫浸浆法制备出nHA晶须增强多孔磷酸钙支架，扫描电镜观察分析支架材料表面形貌，XRD检测其材料组成，液体位移法测试骨支架孔隙率，万能力学测试机测试材料力学强度，同时，按照ISO10993(GB/T16886)生物材料安全性检测规定，对材料细胞毒性试验、急性毒理试验、过敏性和溶血试验进行检测。
　　 结果：我们成功合成了纳米羟基磷灰石晶须，晶须长度在1～2μm左右，直径在60～120nm左右，并且是晶须可以在1000℃下保持晶须形态。通过有机模板法，成功制备出纳米nHA晶须增强多孔磷酸钙支架，XRD检测其主要成分是β-磷酸三钙和羟基磷灰石，孔隙率在72％至93％之间，强度在8.8～10.2MPa，通过SEM观察发现，羟基磷灰石晶须仍保持晶须形态，且均匀分布在支架孔壁中，起到增强补韧的作用。对支架的生物学特性观察发现材料对细胞生长和增殖无不良影响，动物试验急性毒性实验阴性，溶血实验阴性，且无致敏性。
　　 结论：通过水热法与有机模板法等技术成功制备了原位纳米羟基磷灰石晶须增强多孔磷酸钙支架，纳米羟基磷灰石晶须经过高温烧结仍能保持晶须形态，起到强度增加的作用。经过实验证明，nHAw/β-TCP复合支架的生物相容性好，无急性毒性反应和体外溶血反应，是一种理想的人工骨支架。
　　 实验第二部分：nHAw/β-TCP复合支架表面纳米化修饰及孔壁表面纳米效应对成骨细胞的影响
　　 目的：研究支架孔壁纳米化对细胞生物学行为的调控作用机制，以及表面纳米化的骨支架对成骨细胞的生长、增殖、蛋白分泌、钙化和基因表达的影响，探索其对成骨细胞的效应机制。
　　 方法：通过化学沉积法对所制备的人工骨支架进行表面纳米化修饰，通过SEM对支架表面形貌进行观察，随后将MC3T3-E1细胞与支架复合培养，电镜和免疫共聚焦对复合培养后的支架表面进行观察，MTT法检测复合培养1、4、7天后细胞增殖情况，ELSIA法检测支架复合培养1、7、14天后ALP、COL-1、BSP蛋白表现，并对结果进行统计分析。
　　 结果：电镜下观察成骨细胞在表面纳米图案化的骨支架表面的生长情况时可以见到细胞在生长和分裂的时候在细胞的周围长出很多细小的微足，这些微足可以深入并附着在骨支架的纳米图案上。激光共聚焦观察下可见随着培养时间的增加，细胞的数量不断增加，纳米HA晶须增强及孔壁表面纳米化多孔支架组与对照的β-TCP组相比较细胞数量明显较多；MTT法检测显示随着时间增加，两种支架上吸光度值不断增加，且纳米羟基磷灰石晶须增强及表面纳米化人工骨支架上MC3T3-E1细胞的吸光度值在同一时间点上明显高于普通对照组的磷酸钙骨支架，统计学结果显示与对照组比较有显著性差异。ELSLA检测显示随着培养时间的增加，三种蛋白在支架上的表达量不断增加，且在相同时间点上两种支架蛋白表达量经统计分析(P<0.01)，有统计学差异。
　　 结论：孔壁表面纳米化修饰后的支架表面具有纳米级颗粒和沟纹，材料具有纳米颗粒的性质，可以增加细胞的粘附性和促进细胞生长、增殖和分泌功能。
　　 实验第三部分：nHAw/β-TCP复合支架对兔椎体和羊胫骨缺损修复的实验研究
　　 目的：评价孔壁表面纳米化nHAw/β-TCP复合支架对兔椎体缺损和羊胫骨缺损的修复性能。
　　 方法：建立兔L5-6横突间骨缺损的实验动物模型和羊胫骨骨缺损模型，将制备的人工骨支架材料植入缺损部位，对照组使用单纯β-TCP材料。术后12周处死动物取材，通过大体观察、X线观察、电镜观察及组织学来评价支架材料成骨修复情况。
　　 结果：大体观察nHAw/β-TCP复合支架充填的骨缺损处有大量骨痂形成，缺损修复处较牢固，与单纯β-TCP相比，支架与自然骨之间接触要好，缺损处骨修复效果肯定。组织学切片显示nHAw/β-TCP骨缺损处有明显成骨细胞长入，强于单纯β-TCP组。
　　 结论：本实验通过有机模板法制备nHA晶须增强多孔磷酸钙支架骨诱导成骨能力肯定，动物实验无急性毒性反应，具有较高的力学强度和良好的骨替代能力，成功修复了兔横突间缺损和羊胫骨大段骨缺损。