MicroRNA-127在大鼠肝再生过程中的作用机制研究

摘要

肝脏是人体物质代谢、能量转换及营养供应的中枢，是机体内多种重要信息调控分子的“集散地”。与其他器官显著不同的是，平时仅0.0012％～0.01％肝细胞进行有丝分裂，从细胞增殖角度看被认为是一静止器官，但在重大创伤如肝大部切除术、中毒、感染坏死以及肝移植术后等导致部分肝脏丧失后，肝脏细胞能通过DNA合成和有丝分裂重建与机体大小相适应的肝脏体积并恢复功能。在肝脏70％大部切除后的肝再生模型中，肝脏是由剩余的肝叶经1-2周时间增大直至恢复原肝的重量，一旦恢复到原肝的重量，细胞增殖即停止，这一过程被称为肝大部切除后肝再生。在正常情况下人体肝脏在3天内开始增生，在6个月内达到原肝重量。肝再生一直是哺乳动物肝脏研究中的一个重要热点，研究肝再生分子机理必将对肝脏移植、创伤、肝肿瘤等各种肝脏疾病的诊断和治疗具有重要意义。肝脏再生的机制非常复杂，影响因素众多，尽管对肝再生的机制进行了大量的卓有成效的研究，但是对肝再生的分子机理，尤其是肝再生启动的机制仍然需要深入研究。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一类新近发现的内源性调节小RNA，通过与靶基因的互补结合进而调控基因转录后的表达水平，miRNAs参与生物体的生长、发育、疾病和衰老等众多生命过程的各个环节，包括器官发育、物质代谢、细胞分化、凋亡和癌变等等，研究发现生物体内最少有30％的基因受到miRNA的调节，miRNA是目前生命科学的研究热点和前沿领域，而miRNA在肝再生中作用仍然有待于进一步深入阐明，特别是在肝再生的早期miRNA的作用机制鲜见报道。
　　 为了阐明miRNA在肝再生启动阶段的作用，本课题利用经典的大鼠肝再生模型，通过miRNA芯片技术对大鼠肝大部切除3小时后差异表达的miRNA进行了筛选并利用反转录PCR进行验证，发现miR-127的表达下调最明显。为了阐明miR-127在肝再生过程中的作用机制，本课题通过过表达和抑制表达等方法，在细胞、动物和裸鼠荷瘤模型中对miR-127的作用特点及其调节机制进行了研究。
　　 第一部分，miR-127在大鼠肝再生过程中的作用机制研究
　　 虽然有关miR-127在肝再生的作用未见报道，但根据我们对其在肝再生过程中表达的芯片结果提示miR-127在肝再生过程中可能发挥着重要的作用。为了进一步阐明其作用机制，我们首先检测了miR-127及其候选靶基因在整个肝再生过程中的表达情况。并在细胞水平应用microRNAmimics和microRNAinhibitor模拟miR-127的细胞内过表达和下调，对miR-127在正常大鼠肝细胞中的作用进行了初步探讨，特别是miR-127对肝再生过程中常表现出来的生物学改变如细胞的增殖、凋亡和细胞周期的改变的影响进行了探讨。为了阐明miR-127调控细胞生长的机制，我们进一步应用WesternBlotting和qPCR检测了BRL-3A细胞在过表达miR-127后其靶基因的表达情况，并通过荧光素酶报告实验证实了miR-127通过靶基因的3’UTR来发挥抑制Sept7和Setd8的作用。为了阐明miR-127的上游调控机制，我们应用亚硫酸盐测序法验证了其上游启动序列对miR-127表达影响。
　　 我们的结果证实：miR-127在肝再生的早期发挥了重要作用，在肝再生的整个过程中，miR-127的表达呈现先下调后上调的变化，在肝大部切除后24小时下调最为显著；在肝细胞中过表达后具有明显抑制细胞生长和促进细胞凋亡的作用，在肝再生的早期可以通过直接抑制Bcl6、Sept7和Setd8的表达参与肝再生启动过程的调控；而肝再生过程中miR-127的低表达是通过其启动子区的CpG岛的甲基化来调节的。
　　 第二部分，miR-127在肝细胞癌中的作用研究
　　 大量证据显示miRNA在肿瘤的发生发展中起着重要作用。在不同肿瘤中miRNA具有特定的表达模式，具备鉴别肿瘤类型和早期诊断的潜能。肝细胞癌(HCC)是人类最常见的肿瘤之一，在全球肿瘤死亡原因中位列第五，中国大陆肝癌发病率更是占全球发病率的55％，目前在肝癌诊疗中还存在早期诊断难、复发转移率高及治疗手段少的问题，其发生发展的分子机制还有待于进一步阐明。显然，深入研究miRNA在肝癌中的作用和机制将有助于阐明肝癌的发生、发展、转移、侵袭及复发等的分子机制，有助于进一步探索肝癌的早期诊断和治疗的新方法。基于癌症中miRNA的普遍下调以及肝脏再生的启动与肝癌发生相关性我们对miR-127在肝癌中作用做了初步的探讨。
　　 我们的结果显示：miR-127具有抑制人肝癌细胞Huh7胞增殖的作用；与癌旁组织相比人肝癌组织中miR-127的表达明显降低，其靶基因Bcl6的表达则明显升高；在人肝癌细胞系Huh7细胞中miR-127也具有抑制其靶基因Bcl6、Sept7和Setd8的表达的作用；在裸鼠荷瘤模型中证实miR-127可以抑制人类肝癌细胞Huh7细胞形成的肿瘤的增殖。结果提示在人肝癌中miR-127的下调可能通过激活Bcl6的表达发挥促进肿瘤细胞增殖的作用。
　　 结论：miR-127在肝再生早期的下调表达通过直接作用于其靶基因Bcl6、Sept7和Setd8促进了肝再生的启动，而miR-127的下调表达是由其启动子的CpG岛的快速甲基化调节。在人肝癌中miR-127可能通过Bcl6促进肝癌细胞增殖。我们的研究揭示了肝再生早期过程中的一个由miRNA介导的负性调控机制；提示了miR-127在肝癌的诊治中可能具有潜在的应用价值。