进食富含ω-3多不饱和脂肪酸饮食对于反复性轻型颅脑损伤模型大鼠的神经保护作用研究

摘要

背景：
　　 颅脑创伤在一些发达国家已经成为45岁以下人群致死或致残的首要病因。在美国，每年约有170万人遭受不同程度的颅脑外伤。随着社会经济及交通的发展，中国颅脑外伤的发生率以及因颅脑外伤致死及致残率也呈上升趋势。越来越多的脑外伤患者需要接受长期的治疗及生活护理，给家庭及社会带来沉重的经济负担。依据格拉斯哥颅脑创伤评分(GCS)，可将颅脑创伤分为3类：轻型颅脑外伤(格拉斯哥评分13－15分)、中度颅脑损伤(格拉斯哥评分9－12分)以及重度颅脑损伤(格拉斯哥评分≤8分)。轻型颅脑外伤或脑震荡是临床最为常见的颅脑创伤类型，约占临床脑外伤病例的80％。相比于中度颅脑损伤约15％和重度颅脑损伤约40％致死率，约1％的患者死于轻度颅脑损伤。与其他类型颅脑创伤临床表现不同，轻型颅脑外伤主要以头疼、情绪变化、睡眠障碍、记忆力及认知功能障碍为临床表现，临床统称为颅脑创伤后综合征。近年来，关于反复性轻型颅脑创伤已越来越引起研究人员的关注，特别是对于运动员和军人等一些反复轻型脑外伤发生的高比例人群。
　　 各种体外或体内实验显示颅脑损伤初始机制均为外伤导致的级联神经炎性反应以及代谢功能异常。在之前的实验性轻型颅脑外伤模型研究中，单次轻型颅脑创伤后实验对象体内可检测到明显的生化改变，但这些变化均为可逆改变，脑组织功能也可得到完全恢复。目前越来越多的临床及实验室证据表明，反复的轻型颅脑创伤可导致永久性的不可逆脑损伤。
　　 本次实验目的通过建立单次或反复性轻型成年大鼠颅脑外伤模型，记录不同组别颅脑创伤后致死率及体重变化，并通过行为学实验评估不同类型颅脑创伤对实验对象空间获取及记忆存储等认知功能方面的影响。同时，利用不同组织染色方法比较各类型颅脑创伤后急性神经元变性凋亡及长期神经细胞存活情况。同时我们根据前述实验结果给予实验大鼠进食一段时间(伤前4周至伤后2周)富含ω3－多不饱和脂肪酸的饲料，研究其对于反复性轻型颅脑创伤的神经保护潜能。最终建立一种稳定可靠的与战创伤及运动性颅脑创伤相关的实验性脑损伤模型并验证ω3－脂肪酸酸在反复性轻型颅脑创伤中的预防及治疗作用。
　　 第一部分，建立反复轻型创伤性脑外伤模型并比较不同组别脑创伤后致死率及体重变化
　　 一、目的：建立反复轻型性创伤性脑外伤大鼠模型，并记录不同组别死亡率及创伤后体重变化。
　　 二、材料和方法：1)成年雄性SD大鼠47只，体重范围(300-350克)。根据颅脑创伤类型将实验对象随机分为6组：1组(单侧双次，创伤时间间隔6小时，数量=8)；2组(单侧双次，创伤时间间隔24小时，数量=8)；3组(双侧单次，创伤时间间隔1分钟，数量=5)；4组(双侧双次，创伤时间间隔6小时，数量=10)；5组(双侧双次，创伤时间间隔24小时，数量＝8)；6组(对照组，单纯行开颅手术，无颅脑创伤，数量=8)。在动物房内管理饲养一周直至手术。2)实验大鼠行气管插管，呼吸机辅助呼吸，持续性吸入2％异氟烷维持麻醉，术中检测大鼠呼吸、心率及体温变化。根据不同创伤类型，实验对象行单侧或双侧开颅术。实验性颅脑创伤模型由侧方液压打击模型诱导形成，颅脑创伤打击强度根据外接传感示波器测量，本次实验打击强度约为1.25倍大气压力，打击次数及创伤时间间隔根据不同组别创伤类型予以区分。3)记录并比较不同组别实验大鼠颅脑损伤打击强度、脑损伤前后体温及脑温变化以及复苏时间等指标。同时监测各组大鼠脑损伤后恢复情况及体重变化，比较不同组别颅脑外伤后实验大鼠死亡率。
　　 三、结果：1)不同组别实验大鼠颅脑创伤前体重无明显差异，单次颅脑创伤打击强度及颅脑创伤前后体温及脑温变化无显著差异。与单纯行开颅术无脑损伤组术后复苏时间相比，所有类型颅脑损伤组术后复苏时间均显著延长(p<0.05)。双侧轻型颅脑外伤组较单侧轻型颅脑外伤组伤后复苏时间较长，但无明显差异(p=0.578>0.05)，同时我们将本次实验数据与之前中度实验性颅脑创伤后复苏时间相比，所有组别伤后复苏时间明显缩短(p<0.05)。2)相比于实验性中度颅脑外伤约20％死亡率，所有不同类型轻型颅脑损伤组中实验大鼠无一例死亡，脑外伤后死亡率为0。各组别实验对象颅脑外伤后恢复良好，无明显肢体运动及平衡功能障碍。3)脑外伤后不同组别体重变化：所有轻型颅脑外伤组伤后体重均呈下降趋势，比较不同组别脑外伤后体重下降程度及恢复时间，统计分析结果显示：1)双侧多次轻型颅脑损伤组较单侧多次轻型颅脑损伤组，脑外伤后体重下降程度更严重，恢复至伤前体重水平所需时间明显延长(5天vs11天)；2)双侧多次轻型颅脑损伤组较双侧单次轻型颅脑损伤组，脑外伤后体重下降程度明显，恢复至伤前体重水平所需时间明显延长(5天vs11天)；3)单侧多次轻型颅脑损伤组与双侧单次轻型颅脑损伤组相比，脑外伤后体重下降程度及恢复至伤前体重水平所需时间无显著差别(5天vs5天)。
　　 四、结论：
　　 1.所有类型轻型颅脑损伤组别术后复苏时间较无损伤组均显著延长(p<0.05)。双侧轻型颅脑外伤组较单侧轻型颅脑外伤组伤后复苏时间较长，无统计学意义。与中度颅脑创伤相比，各类型轻型颅脑外伤伤后复苏时间显著缩短(p<0.05)，有统计学意义。由此推测反复性轻型颅脑创伤其脑组织损伤程度较单次轻型颅脑损伤较轻，脑组织功能恢复时间较短。
　　 2.相比于实验性中度颅脑外伤(致伤强度约为2.15倍大气压力)约20％的死亡率，所有不同类型轻型颅脑损伤组中实验大鼠无一例死亡，脑外伤后死亡率为0。各组别实验对象颅脑外伤后恢复良好，无明显肢体运动及平衡功能障。由此推测打击强度是导致实验对象脑外伤后死亡的主要因素，反复性轻型颅脑创伤强度不同于单次中度颅脑创伤。
　　 3.双侧多次轻型颅脑损伤组较其他类型轻型脑损伤组可产生明显的体重下降，其恢复至脑损伤前体重水平所需时间明显延长。可认为多次反复性轻型颅脑损伤脑组织损伤程度较重，恢复时间相对较长。
　　 第二部分，评估不同类型反复轻型创伤性脑损伤后对其认知功能的影响
　　 一、目的：通过颅脑创伤后连续5天行为学测试，观察并评估不同类型反复轻型创伤性脑损伤后对其认知功能的影响。
　　 二、材料和方法：将不同类型轻型颅脑外伤组自脑创伤后12-16天连续5天行Morris水迷宫行为学测试。整个行为学测试分为定位航行测试(placenavigation)及空间探索测试(spatialprobe)。1)定位航行测试：连续5天，每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间及游动速度和距离；2)空间探索测试：是在定位航行试验最后一天测试后去除平台，然后选定一个入水点将大鼠放入水池中，记录其在一定时间内的游泳轨迹，考察大鼠对原平台的记忆。
　　 三、结果：
　　 1)所有不同类型轻型颅脑损伤组别中实验对象的游动速度及视力测试均无明显差异。
　　 2)与无损伤对照组相比较，单侧双次轻型颅脑损伤组中大鼠在测试1-2天存在明显认知功能障碍，双侧单次轻型颅脑损伤组中大鼠在测试1-3天存在明显的认知功能障碍，而双侧多次轻型颅脑损伤组中大鼠则在测试1-5天内存在认知功能障碍。3)与无损伤对照组最终测试结果相比，双侧多次轻型颅脑损伤组中实验大鼠存在明显认知功能障碍(第四组，p=0.003/第五组，p<0.001)，而单侧多次及双侧单次轻型颅脑损伤组中实验大鼠与无损伤组比较无显著差别。
　　 3)空间探索测试显示：多侧反复轻型颅脑创伤组其各区域内游动轨迹相对较平均，而其他各组则表现出目标区域相对集中性。
　　 四、结论
　　 1.单侧多次及双侧单次轻型颅脑损伤组对脑创伤后认知功能无显著影响，可推测其损伤程度较轻，脑组织未造成永久性损伤，脑组织功能未受明显影响。
　　 2.反复性轻型颅脑外伤可造成明显的认知功能障碍，由此推测对于双侧重复性轻型脑创伤，6小时或24小时的时间间隔对于脑组织的功能恢复不够充分，应此连续的轻型脑创伤均可加重颅脑损伤程度。虽然与单次中度创伤性脑损伤相比，反复轻型颅脑创伤损伤程度更轻微，但重复的创伤累积可产生更为严重的长期性认知功能障碍。
　　 第三部分，比较不同类型反复性轻型颅脑损伤后脑组织观察区域急性神经元变性及长期神经细胞生存状况
　　 一、目的：比较不同组别脑外伤后神经细胞存活情况，研究不同类型轻型颅脑损伤对脑组织的损伤程度。
　　 二、材料和方法：
　　 更据不同类型组织学染色要求，分别随机抽取不同组别实验大鼠于伤后24小时内或行为学测试最后一天(脑创伤后16天)通过4％多聚甲醛灌流(每只大鼠约150毫升)并固定脑组织，经不同浓度蔗糖溶液浸泡保护后，将脑组织至于干冰冷冻，于切片机上将冰冻脑组织以每层45微米的厚度连续冠状切片，选取10张脑组织贴片。室温晾干组织切片后，分别行FluoroJade-B组织荧光染色及甲酚紫(CV)染色评估不同组别神经细胞受损情况，同时与先前实验性中度创伤性脑损伤大体脑组织形态及神经细胞存活情况相比较，并进行统计学分析。
　　 三、结果：
　　 1)脑外伤后16天脑组织大体形态学比较：与中度颅脑创伤后受伤区域脑组织常可见连续性疤痕或组织缺损不同，仅双侧多次或单侧双次轻型颅脑损伤组脑组织损伤局部可见轻微皮层下瘢痕或含铁血黄素沉积，其余单次轻型脑创伤组脑组织打击致伤区域未见明显疤痕或脑组织皮层缺损。光镜下甲酚紫(CV)染色结果同时显示，所有反复性轻型颅脑损伤组大鼠脑组织损伤相关区域未见缺血梗死或出血灶及外伤后瘢痕组织形成。
　　 2)所有不同类型轻型脑创伤组其创伤区域的顶叶皮层及丘脑均可见明显的FJ-B阳性荧光染色(p<0.05)，随着打击次数的增加，脑损伤后急性神经元变性数量随之增加，利用立体测量细胞计数软件分析系统计算比较不同脑损伤组别外伤后急性期变性死亡的神经细胞数量结果显示单次反复性轻型颅脑损伤较单侧单次轻型颅脑损伤相比，表现出增加神经细胞变性数量的趋势。
　　 3)通过甲紫酚染色观察比较不同类型反复性轻型颅脑损伤后同侧脑组织海马CA3区长期神经细胞存活数量结果提示所有不同类性颅脑损伤后均可导致不同程度的长期存活神经细胞数量下降，且各不同组别脑外伤后神经细胞存活数量有显著差异(p<0.01)。单次轻型颅脑损伤后神经细胞存活数量与无损伤组无显著差别(p>0.05)。反复性即同侧2次轻型颅脑损伤，无论创伤时间间隔6或24小时，均可产生最显著的神经细胞数量下降(p<0.01)。
　　 四、结论
　　 1)伤后24小时FJ－B荧光染色结果提示各种类型轻型颅脑损伤均可造成受伤区域海马及皮层不同程度急性神经细胞变性死亡，反复性轻型颅脑由于打击次数增加，可导致急性脑损伤程度加重及表现出增加变性神经细胞数量的趋势。
　　 2)伤后脑组织大体形态学表明，脑组织机械损伤程度主要与瞬间颅脑打击强度有关，轻型颅脑损伤由于脑组织机械性打击程度较轻，相比于中度颅脑损伤，脑组织大体形态病理学无特殊改变。
　　 3)甲酚紫(CV)染色结果显示多次反复轻型颅脑损伤可恶化继发性脑损伤程度，表现为显著增加脑组织损伤相关区域神经细胞丢失数量，造成脑组织不可逆的损伤。
　　 第四部分，ω3－鱼脂酸对反复性轻型创伤性脑损伤保护作用的实验研究
　　 一、目的：确立ω3－鱼脂酸对反复性轻型颅脑损伤的神经保护作用并探讨其对脑外伤后大鼠认知功能的影响。
　　 二、材料和方法：
　　 将32只实验大鼠(体重约150克，出生时长：6周)随机根据饲养食物不同分为两组，每组各16只，其中一种食物中富含ω3－鱼脂酸，而另一组食物以普通实验饲料为对照。所有大鼠与脑损伤前4周开始进食不同食物，并持续进食至伤后2周，直至行为学实验完成。实验期间记录每天不同组别实验动物的体重变化。颅脑创伤后10－14天连续5天行Morris水迷宫行为学测试，分别记录每只实验大鼠游向平台时间及游行速度。评估空间认知及记忆功能。行为学测试最后一天(脑创伤后16天)通过4％多聚甲醛灌流(每只大鼠约150毫升)并固定脑组织，经不同浓度蔗糖溶液浸泡保护后，将脑组织至于干冰冷冻，与切片机上冠状切面将冰冻脑组织以每层45微米的厚度切片、贴片。室温晾干组织切片后，行甲酚紫(CV)染色评估不同组别神经细胞受损情况，并进行统计学分析。
　　 三、结果：
　　 1)两组中颅脑外伤打击强度、伤后意识及反射恢复时间、损伤前后体温及脑温变化无显著性差别。颅脑外伤前进食不同食物4周时间，各组别大鼠体重增长比率无差别，但伤后体重记录显示，进食富含ω3－鱼脂酸饲料组大鼠可明显减轻体重减少程度(311±25gvs321±22g)，恢复至脑外伤前基础体重时间较对照饮食治疗组缩短。
　　 2)两组不同饮食组于脑损伤后10－14天行水迷宫行为学评估，其中各组中实验对象的游动速度及视力测试均无明显差异。进食富含ω3－鱼脂酸饲料的实验大鼠脑外伤后较进食普通饲料的实验大鼠在认知功能方面有明显改善。比较行为学测试最后一天各组别游向平台时间，ω3－鱼脂酸饮食组平均用时显著缩短(p=0.030,p<0.05)。空间探索测试结果显示，二组实验大鼠均表现出目标区域相对集中性，进食富含ω3－鱼脂酸组大鼠与目标区域游动时间相对较长(22.8±3.6秒vs19.7±2.9秒)。
　　 3)组织学检查结果：各组别大鼠与行为学测试最后一天(脑外伤后16天)处死，提取脑组织标本行甲酚紫(CV)染色，用以评估不同组别神经细胞长期生存状况。脑组织大体形态学比较(4×)：进食普通实验饲料组大鼠较进食富含ω3－鱼脂酸组大鼠相比，其脑组织海马颗粒层厚度及细胞密度减少。光镜下甲酚紫(CV)染色结果同时显示(100×)，不同饮食组双侧海马CA2/3区域平均神经细胞数量比较结果上无显著性差异(左侧：p=0.149p>0.05；右侧：p=0.253p>0.05)，然而，进食富含ω3－鱼脂酸组显示出可减少神经细胞死亡的趋势。
　　 四、结论
　　 1)各组大鼠伤后无死亡率。脑外伤前至伤后一段时间进食ω3－脂肪酸，可满足机体颅脑外伤后的高代谢及能量需求状态，明显减轻反复性轻型颅脑创伤后体重下降，促进神经功能恢复，改善伤后恢复。
　　 2)反复性轻型颅脑损伤组可产生明显的认知功能障碍，进食富含ω3－鱼脂酸饲料可明显改善脑外伤后空间认知及记忆功能，并显示出更明显的目标区域的偏好性。
　　 3)甲酚紫(CV)染色结果显示虽然二组不同饮食组在平均神经细胞数目皮较无显著性差异，但与进食普通实验饲料组大鼠相比，进食富含ω3－鱼脂酸饲料的大鼠显示出增加脑外伤后长期神经细胞存活数量的神经保护潜能。