甘草甜素在脊髓缺血再灌注损伤中的保护作用的实验研究

摘要

目的：
　　 脊柱骨折脱位或脊髓慢性压迫均可造成脊髓的缺血再灌注损伤。脊髓缺血再灌注损伤(SCII)是指脊髓损伤等导致脊髓缺血的因素去除后，脊髓恢复血供，神经功能不仅得不到改善，反而在原缺血损伤基础上进一步加重，甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象。缺血再灌注损伤在脊髓损伤后的继发损伤(SecondarySCI)中扮演了重要角色。近年来的研究发现，炎症反应广泛的存在于脊髓缺血再灌注后引起的神经损伤的病理过程中。而这一过程给当前治疗脊髓缺血再灌注损伤提供了一个潜在的介入点。HMGB1是一组与染色质相关的蛋白，由于在凝胶电泳时具有高移动性，所以被命名为高迁移性蛋白组(highmobilitygroup)，其中的HMGB1在细胞发生坏死时扩散到细胞外液中。一旦被分泌或扩散到细胞外夜中，HMGB1能够开启包含HMGB1/TLR-4/NF-κB的危险信号分子通路，加剧炎症反应。甘草甜素(Glycyrrhizin)为中药甘草有效成分的第3代提取物，主要成分为α体甘草甜素盐成分，具有较强的非特异性抗炎作用和类激素作用。本实验运用小鼠脊髓缺血再灌注模型，观察小鼠缺血再灌注模型后脊髓组织中HMGB1、RAGE、TLR-4和NF-κB的活性形式磷酸化的P65(PP65)的变化以及甘草甜素对其干预的影响，探讨甘草甜素在脊髓缺血再灌注损伤中的保护作用机制，为其在临床治疗脊髓缺血再灌注损伤提供理论基础。
　　 方法：
　　 选取第二军医大学免疫学教研室饲养的雄性C57BL/6小鼠作为实验动物。通过显微镜下开胸手术，显微血管夹夹闭法阻断小鼠的主动脉弓(位于左颈总动脉与左锁骨下动脉之间)、左锁骨下动脉(起始部，位于胸廓内动脉分支之前段)来造成C57BL/6小鼠的脊髓缺血，缺血时间分别为10min及15min组，通过预实验检验发现15min组建模成功率更高，后所有实验组均采取15min缺血时间。实验动物分为三组(每组n=6)：实验组、假手术组、对照组(阻断缺血后给予等量PBS)和甘草甜素组(10mg/kg，阻断缺血后给药)。术后实验动物均同条件饲养，选取术后3小时、6小时、12小时、24小时、3天、7天共六个时间节点，通过心脏甲醛灌注法处死，完整取下小鼠全段脊髓组织，液氮冷冻保存材料。术后运动功能评价通过后肢运动功能评分法来定性研究。小鼠脊髓组织病理学观察通过使用H&E染色发进行比较对照研究。通过RT-PCR或ELISA检测法对不同时间节点再灌注损伤后脊髓组织内炎性细胞因子在mRNA水平或蛋白水平及其受体表达的变化进行了测定。通过Western-blot方法检测测定NF-κB的活性亚体pp65的活性，从而定量分析其活化情况。本实验所有的量化数据均表示为平均值±SD。统计数据比较使用单因素方差分析法。对于神经功能缺损评分等定性数据，采用Mann-WhitneyU检验法进行两组之间的比较。定义P<0.05差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 甘草甜素组与对照组相比，显著改善神经系统的功能，减少脊髓前角运动神经元细胞凋亡，降低NF-κB的激活和随后的炎性细胞因子的表达(TNF和IL-1β)，减轻缺血后脊髓组织内的中性粒细胞的浸润。针对HMGB1的特异性阻断治疗也减少了其自身的表达。HMGB1作为公认的一个关键因素介导着体外和体内神经元损伤的细胞反应。在我们的模型中，HMGB1在非常早期的阶段即显著增加，在缺血再灌注损伤一天后达到高峰。直到第7天它们仍保持在高水平，虽然略有逐渐减少的趋势。我们还发现，HMGB1受体RAGE和TLR4的表达水平在此过程中同时明显升高。放大后的HMGB1的信号通路反馈机制及其介导的炎症反应导致了脊髓损伤的进一步加剧。然而，这也表明，在早期针对性的抑制HMGB1可能提供极大的好处，并作为治疗缺血再灌注损伤有吸引力的策略。在日本，甘草甜素作为一种传统中药制剂多年来已被用于对乙型和丙型肝炎的治疗。后来，甘草甜素发现可以与HMGB1结合，抑制其细胞因子作用，提示在炎症反应相关疾病中的广泛应用前景。同时我们发现，甘草甜素能抑制NF-κB活化及炎性细胞因子的后续产生。缺血再灌注后HMGB1的主要来源仍然不明朗。在早期缺血后，可能主要来源于薄壁细胞和非实质细胞受损或坏死的释放，以及从细胞核内主被动分泌而来。这些HMGB1刺激受伤组织中的单核细胞、巨噬细胞或中性粒细胞产生炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子、IL-1、IL-8等。，反过来这些细胞因子通过诱导单核细胞和巨噬细胞自分泌或旁分泌方式的方式来刺激HMGB1的分泌。因此，在缺血再灌注脊髓损伤的晚期，局部存在或聚集的巨噬细胞主动分泌HMGB1的可能可能是Hmgb1维持高水平的主要原因，并导致了炎症相关疾病的持久存在。甘草甜素不仅在早期阶段阻断HMGB1的活性，同时也减少其在后期的表达水平。NF-κB是一个关键的核转录因子，转录调节许多炎症相关的基因，并肯定与脊髓缺血再灌注损伤呈正相关。在本研究中，我们也观察到NF-κB的转录和表达的增加以及激活和缺血再灌注后的核易位。HMGB1的启动、激活和易位可能代表下游危险信号通路的打开及反馈性放大。甘草甜素治疗通过抑制NF-κB活化，减少炎性细胞因子的产生。
　　 结论：
　　 甘草甜素对小鼠脊髓缺血再灌注损伤具有保护作用和减轻炎症反应的作用。总之，我们的研究表明，HMGB1和其受体RAGE和TLR4的表达上调缺血再灌注损伤的脊髓损伤。甘草甜素政府在缺血发作有效降低NF-κB活化，从而保护神经功能缺损的老鼠。此外，甘草甜素也减少了持久的HMGB1产生，通过切断HMGB1的正反馈回路。我们的发现为研究脊髓缺血再灌注损伤的实验和治疗措施提供了新的选择。