新型mTOR抑制剂Y31抑制人多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖及机制研究

摘要

常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是人类最常见的单基因遗传性肾病，发病率约为1/1000～1/400,据此估计我国ADPKD患者约有150万[1]。大约一半ADPKD患者在60岁时最终发展至终末期肾病[2]。ADPKD主要病理特征是双肾广泛形成液性囊肿，并进行性增大，最终破坏肾脏正常结构和功能，发展至终末期肾脏疾病，需血液透析治疗。ADPKD的发病机制目前尚未被完全阐明，也未找到有效的治疗药物。现今ADPKD的研究仍主要集中在囊肿形成过程中的细胞增殖与凋亡的分子机制，希望能寻找到新的治疗靶点和有效的药物。
　　 mTOR(mammaliantargetofrapamycin，)信号通路参与ADPKD的发生、发展过程已得到公认，且有多项研究也显示，在体外细胞实验和多种ADPKD模型动物中，mTOR抑制剂雷帕霉素具有抑制肾小管上皮细胞增殖和肾囊肿形成的作用[3]；前期的临床试验结果也提示雷帕霉素在ADPKD发展的不同阶段均呈现出有效的治疗效果，且未发生雷帕霉素的副作用。但是，近期国外权威杂志报道了两个传统mTOR抑制剂治疗ADPKD的临床试验结果，证明单用传统mTOR抑制剂对ADPKD患者治疗效果不甚明显。
　　 为此，我们在与中科院药物所合作共同研制新型mTOR抑制剂Y31，其药代动力学及水溶性都优于雷帕霉素。旨在观察其对肾囊肿衬里上皮细胞增殖、周期和凋亡的影响及机制，探讨Y31应用于临床治疗ADPKD的前景。
　　 实验所用的WT9-12细胞株由美国哈佛大学周京教授馈赠，是来源于人ADPKD患者肾脏囊肿衬里上皮永生化的细胞系。WT9-12细胞在分别给予不同浓度的Y31干预培养24、48、72和96h后，MTT法检测结果显示Y31可明显抑制WT9-12细胞增殖，并呈现出时间和剂量的依赖性，其作用72h的50％抑制率浓度为25μmol/L。流式细胞技术分析结果显示WT9-12细胞在给予浓度为25μmol/L的Y31作用72h后，可明显阻滞细胞周期，使之被阻滞于G0/G1期，使G0/G1期细胞数增加了将近10％；同时也诱导细胞凋亡，使细胞早期凋亡率增加近28.5％，两者较对照组在统计学都表现明显差异(P<0.05)。此外，Westernblot方法检测结果提示，WT9-12细胞在给予浓度为25μmol/L的Y31作用72h后，其细胞周期负性调控蛋白p21的表达明显增加，而cyclinD的表达却减少；反映细胞凋亡的PARP蛋白表达也明显上调。综上所述，表明mTOR抑制剂Y31对WT9-12细胞增殖的抑制作用是通过阻滞细胞周期于G0/G1期和促进细胞凋亡的机制实现，与流式细胞技术分析的结果相符。
　　 mTOR信号通路在多囊肾病的发生、发展中起重要作用，抑制mTOR信号通路可明显抑制多囊。肾病的进展，p70S6K及4E-Bp1是mTOR两个主要的下游底物。在给予WT9-12细胞不同浓度的Y31作用72h后，Westernblot方法检测结果显示Y31可下调p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达，而对另一个底物4E-Bp1的磷酸化水平却无明显影响。
　　 细胞死亡的形式有细胞坏死、细胞凋亡和细胞自噬。mTOR信号通路除了调节细胞凋亡外，同时又是细胞自噬的重要调节蛋白。已有多项研究表明自噬增加有抑癌效应，过量自噬导致的自噬性死亡可以杀灭肿瘤细胞。本实验也检测了细胞自噬相关的重要蛋白LC3和Beclin1，结果显示Y31可使LC3和Beclin1表达增加，表明Y31可促进细胞自噬性死亡，细胞自噬是Y31抑制WT9-12细胞增殖的另一机制。
　　 总之，本研究表明新型mTOR抑制剂Y31主要作用是通过mTOR复合物-1(mTORC1)抑制其下游分子p70S6K的磷酸化水平，以阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡，最终抑制肾囊肿衬里上皮细胞的增殖，并可促进细胞自噬性死亡。