组织工程化心传导束的构建及体内移植

摘要

完全性房室传导阻滞是心脏内外科多种疾病的常见并发症，严重危害人类健康，目前临床主要采用植入电子起搏器的方法对其进行治疗。尽管心脏电子起搏器作为姑息治疗的效用性不容置辩，但其引起的并发症却不能忽视，尤其是对于儿童，其长期治疗效果不容乐观。因此，现阶段迫切需要一种改进的治疗方法。
　　 近年来，组织工程技术已被证实是解决组织创伤修复和功能重建的有效途径之一。已有研究探讨了利用建立房室通路的方法，再建房室传导的可行性。本研究拟用胚胎心脏祖细胞（embryonic cardiac progenitor cells，ECPC）与胶原海绵复合，体外构建组织工程化心传导束;研究其传导特性，以及治疗大鼠房室传导阻滞(atrioventricular block，AVB)的效果;以探讨组织工程化心传导束移植治疗心房室传导阻滞的可行性。
　　 第一部分组织工程化心传导束的体外构建
　　 目的:体外构建具有生理功能的组织工程化心传导束。
　　 方法:取大鼠11.5天胚胎心管，酶消化法分离细胞，贴壁培养。观测细胞形态、自发搏动情况、标志分子表达等，鉴定细胞。
　　 将ECPC调整细胞密度为1×107/ml，种植于15×5×2mm胶原海绵上，构建组织工程化心传导束。检测培养1、2、3w复合体的组织相容性和电传导特性。
　　 结果:原代ECPC呈圆形、长梭形或三角形，搏动频率可达400次/分。细胞免疫荧光方法检测，OCT4、Nkx2.5、Vimentin阳性表达，SOX2、HCN4、CX45、α-SCA、cTnT、Tbx3表达弱阳性，SSEA-1、CX40、CX43、HCN2、和Ⅷ因子均为阴性。
　　 构建的组织工程化心传导束，ECPC与胶原海绵具有良好的生物相容性，缝隙连接蛋白表达;具有类似在体心传导束的电传导速度。
　　 结论:将ECPC种植于胶原海绵上，可以构建具有传导功能的组织工程化心传导束。
　　 第二部分组织工程化心传导束的形变
　　 目的:观测组织工程化心传导束的形变，探讨其发生机制，研究碱性FB生长因子(bFGF)对组织工程化心传导束形变的作用及机制。
　　 方法:利用组织形态学方法观测构建的组织工程化心传导束的形变;采用免疫荧光检测ECPC中α-SMA的表达;细胞培养按50ng/ml的浓度加入bFGF，采用免疫荧光、实时定量PCR(real-time PCR，Q-PCR)、酶联免疫吸附法(ELISA)、Western Blot等方法，检测ECPC培养1d、2d、3d时α-SMA的表达;细胞-支架复合体培养，按50ng/ml的浓度加入bFGF，观测复合体形变、细胞生存活力、电传导功能，免疫荧光、Q-PCR、ELISA等方法，检测培养2d、8d、14d时复合体α-SMA的表达。
　　 结果:组织工程化心传导束体外培养第1d始发生形变，2w内形变速度大，3w时基本不再发生形变。ECPC中α-SMA高表达。加入bFGF，细胞α-SMA表达降低;细胞-支架复合体α-SMA表达降低、形变改善，细胞生存活力提高，电传导功能没有改变。
　　 结论:α-SMA高表达是组织工程化心传导束发生形变的主要原因。bFGF通过降低α-SMA的表达，改善组织工程化心传导束的形变。加入bFGF，对组织工程化心传导束的传导功能没有影响。
　　 第三部分组织工程化心传导束的体内移植
　　 目的:探讨组织工程化心传导束移植治疗大鼠房室传导阻滞的可行性。
　　 方法:成年SD大鼠15只，进行开胸手术，将20μl的70％乙醇注射到心房室结处。心电图，动物苏醒前实时观测，苏醒后隔天检测，持续3m。组织形态学检测2m时模型心房室结的损伤情况。
　　 体内移植实验分假手术组、空支架组和细胞-支架复合体组。假手术组:在心脏房室交界处去除心外膜，用缝合线在此处缝合两针;空支架组和复合体组:去除右房室交界近主动脉处心外膜，分别将体外培养1w，大小约7×3×2mm的空支架和复合体移植此处，两端分别用缝合线固定于心房和心室。手术后20d、40d、2m和3m，检测体表心电图。空支架组和复合体组移植区取材，观测形态学变化。
　　 三组动物手术后20d、40d、2m和3m分别二次开胸行心房室结损坏，心电图同步检测阻滞后1h、5d、10d、20d、40d、2m、3m、4m、5m、1y的变化。
　　 结果:心房室结乙醇注射后心电图检测，1h内全部发生完全性房室传导阻滞，1h后心脏阻滞有恢复现象，个别个体心脏阻滞可持续3m。组织形态学显示，阻滞模型心脏房室结处有损伤。
　　 组织工程化心传导束移植，移植手术后20d、40d、2m和3m，假手术组、空支架组心电图正常，细胞-支架复合体组出现预激综合征。形态学结果表明，细胞-支架复合体移植物与心肌连接紧密，移植物内的胶原海绵随时间而逐渐降解，细胞和细胞外间质逐渐增多、缝隙连接蛋白表达。
　　 心房室结阻滞后1h内，假手术组无一阻滞恢复;空支架组仅有1只(1/24)阻滞恢复;细胞-支架复合体组阻滞恢复率达存活动物80％、且移植时间越长，阻滞恢复率越高，阻滞后5d时，复合体移植动物阻滞全部恢复。假手术、空支架组随时间延长阻滞恢复增多。
　　 结论:乙醇注射心房室结可制备大鼠房室传导阻滞动物模型。组织工程化心传导束在体内存活、与心肌细胞紧密连接、出现预激综合症征。组织工程化心传导束移植，可以在房室传导阻滞时，建立房室传导通路。

目录

声明

摘要

英文缩写表

前言

第一部分 组织工程化心传导束的体外构建

一、前言

二、实验材料和设备

(一)主要实验试剂

(二)主要实验设备

(三)主要用液配制

三、实验方法

(一)SD大鼠ECPC的分离、培养及鉴定

(二)组织工程化心传导束的构建及体外培养

四、实验结果

(一)SD大鼠ECPC的分离、培养及鉴定

(二)组织工程化心传导束的构建及体外培养

五、讨论

第二部分 组织工程化心传导束的形变

一、前言

二、实验材料和设备

(一)主要实验试剂

(二)主要实验设备

(三)主要用液配制

三、实验方法

(一)组织工程化心传导束的形变

(二)ECPC细胞α-SMA的表达

(三)bFGF对ECPC细胞α-SMA表达的影响

(四)bFGF对组织工程化心传导束形变的作用及机制

四、实验结果

(一)组织工程化心传导束的形变

(二)ECPC细胞α-SMA的表达

(三)bFGF对ECPC中α-SMA表达的影响

(四)bFGF对组织工程化心传导束形变的作用及机制

五、讨论

第三部分 组织工程化心传导束的体内移植

一、前言

二、实验材料和设备

(一)主要实验试剂

(二)主要实验设备

(三)主要用液配制

三、实验方法

(一)SD大鼠房室传导阻滞模型的建立

(二)组织工程化心传导束的体内移植

(三)组织工程化心传导束移植治疗心传导阻滞的作用

四、实验结果

(一)SD大鼠房室传导阻滞模型的建立

(二)组织工程化心传导束的体内移植

(三)组织工程化心传导束移植治疗心传导阻滞的作用

五、讨论

参考文献

全文小结

创新点及意义

综述

在读期间发表的文章及成果

致谢