miRNAs在雷公藤甲素抗肝癌效应中的作用及机制研究

摘要

背景及目的:
　　 原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，具有早期诊断难，病程进展快，病死率高等特点，被称为“癌中之王”。全球每年有超过600000人死于肝癌，死亡人数居所有肿瘤相关死亡第三位。研究表明，肝癌的发生与慢性病毒性肝炎、酒精性肝病及黄曲霉素摄入有密切关系。我国有数目庞大的慢性乙型肝炎患者及乙肝病毒携带者，肝癌发病率居全球第一位，给我国带来了沉重的疾病负担和巨大经济损失。目前，肝癌最有效的治疗手段是手术切除，但是在我国，大部分患者在确诊时病程就已进入了中晚期，失去了手术治疗的机会。中晚期肝癌患者对常规放、化疗不敏感，而以索拉菲尼为代表的新型靶向治疗药物价格又过于昂贵且对患者预后改善不明显，使得这些治疗手段的应用受到限制，严重影响了患者的预后。因此，研发价格低廉的新型有效药物对于提高我国肝癌的治疗水平，减轻全社会的疾病负担具有重大的现实意义。
　　 微小RNA(miRNA)是一种内源性非编码小RNA，大小约17-25个核苷酸(nt)，在生物界广泛存在。miRNA的生物合成比较复杂，首先由RNA聚合酶Ⅱ催化合成miRNA的初始转录子(pri-miRNA)，然后pri-miRNA在细胞核中被核酸酶RNaseⅢ Drosha切割成为前体miRNA(pre-miRNA)。经过进一步剪切后，pre-miRNA在转运蛋白exportin-5的作用下由细胞核内转移到细胞质中，最后由另一种核酸酶RNaseⅢDicer进一步切割产生具有一定生物学功能的成熟体miRNA。miRNA通过与目标信使RNA(mRNA)非完全配对，导致目标mRNA降解或者翻译受阻，从而调控靶基因的表达。miRNA对生物体的生长和发育起重要调节作用，其表达异常与多种疾病发生发展密切相关。大量研究发现，miRNA在很多肿瘤中异常表达，与肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、侵袭和转移等生物学特性联系密切。肝癌的发生发展也与miRNA异常表达密切相关。那么，调节异常表达的miRNA使其恢复至正常水平，是否有可能逆转肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移等生物学特性呢？Kota J等的研究首度为我们揭示了这种可能。他们发现miR-26a在HCC中异常低表达，在免疫缺陷鼠肝癌模型中人为高表达miR-26a，可以特异性的诱导肿瘤细胞凋亡，明显延缓肿瘤进展。该研究证明以miRNA为肿瘤治疗靶点可以通过诱导肿瘤细胞凋亡等途径，取得良好的治疗效果，宣告了以miRNA为治疗靶点的分子靶向治疗新时代的来临。
　　 甲素是提取自中药雷公藤的一种二萜内酯类化合物，具有抗炎，抗风湿，抗免疫排斥，抗肿瘤等多种生物学活性，极具研究价值和应用前景。自1972年首次被分离和鉴定以来，世界各地的研究人员一直尝试从各个角度揭示甲素多种生物活性的相关分子机制，努力寻找和定位甲素相关药理作用的靶分子。既往的研究表明，甲素的多种生物学活性与其转录抑制效应密切相关，比如在免疫调节作用方面，核心机制是甲素通过抑制核转录因子NF-κB的转录活性减少炎症因子产生，从而减弱相关免疫反应;在抗瘤作用方面，甲素的诱导肿瘤细胞凋亡作用亦与其对NF-κB的转录抑制效应密切相关。另外，甲素对转录因子HSF-1和AP-1的抑制作用也是其抗瘤效应的重要机制。由此我们可以得出一个初步结论，即甲素的转录抑制作用是其产生相应生物学效应的基础。
　　 越来越多文献表明，甲素具有非常广泛的转录抑制活性。McCallum等研究证实甲素能够抑制肿瘤细胞核糖体RNA(rRNA)的转录;Crews证实甲素能够抑制RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ)的Ser2位点的磷酸化，从而抑制RNA聚合酶Ⅱ的转录活性;Stéphane Vispé等进一步证实甲素能够明显降低肿瘤细胞内由RNA聚合酶Ⅱ催化转录的信使RNA(mRNA)的表达。Liu等人进一步研究表明，甲素能够与通用转录因子TF(Ⅱ)H的核心亚单位ERCC3(又称XPB)特异性结合，从而抑制后者的ATP酶活性，导致TF(Ⅱ)H参与的、由RNA聚合酶Ⅱ介导的基因转录受阻。那么甲素是否能够抑制人RNA组中另外一个重要组成部分——微小RNA(miRNA)的转录呢？遗憾的是国内外关于这个问题的研究尚处于空白，无法找到现成答案。我们知道miRNA是一种内源性非编码小RNA，大小约17-25个核苷酸(nt)，在生物界广泛存在。miRNA通过与目标mRNA互补配对，导致目标mRNA降解或者翻译受阻，从而调控靶基因的表达，调节生物体的生长和发育。研究表明，miRNA的初始转录子(pri-miRNA)由RNA聚合酶Ⅱ催化合成。既然miRNA由RNA聚合酶Ⅱ负责转录，而甲素能够抑制RNA聚合酶Ⅱ的催化活性，那么我们可以合理假设甲素也能够抑制miRNA的转录。
　　 本课题拟针对这一设想进行研究，探讨甲素抗肝癌效应的相关分子机制。主要研究包括:(1)明确甲素对人肝癌细胞的生长抑制效应和诱导凋亡作用;(2)明确甲素对miRNA的转录调节作用及该作用对甲素诱导肝癌细胞凋亡效应的影响，探索其中的分子机制;(3)明确甲素对裸鼠荷瘤模型的体内抑制效应，并验证相关分子机制。
　　 方法:
　　 1、CCK-8细胞增殖实验检测甲素对多种肝癌细胞的增殖抑制作用及其时间剂量关系，流式细胞仪检测甲素诱导HepG2细胞凋亡的效应及其时间剂量关系，PI单染法流式细胞仪检测甲素对肝癌细胞周期分布的影响，免疫印迹、qRT-PCR及报告基因方法检测甲素刺激后人肝癌细胞HepG2内凋亡及生长增殖相关信号通路的变化，并使用基因过表达或者基因干扰的手段上调或者抑制相应蛋白的表达以改变该信号通路的活化状况，观察其对甲素促凋亡效应的影响，明确相应信号通路与甲素凋亡诱导效应的关系，揭示其分子机制。
　　 2、建立能稳定表达荧光素酶的肝癌细胞株HepG2-luc，利用该细胞株建立裸鼠肝癌种植瘤模型，随机将裸鼠分为阴性对照组(DMSO)、甲素给药组(0.2mg/kg/day)、阳性对照组(1mg/kg/day)，经腹腔注射途径连续给药14天，利用小动物活体成像技术及时监测各组间肿瘤组织内荧光信号强度，并观察有无远处转移情况。给药结束后获取肝癌组织样本和血液标本，TUNEL法检测裸鼠肝癌组织内细胞凋亡情况，IHC法检测相应蛋白表达情况，并检测血清内相应生化指标以评估甲素对裸鼠肝肾功能的影响。
　　 3、miRNA芯片检测甲素刺激后HepG2细胞内miRNA表达谱的改变，生物信息技术筛选差异miRNA及所调控的信号蛋白和通路，qRT-PCR验证miRNA芯片的准确性;ChIP技术检测转录因子c-Myc与miRNA编码基因5'端序列特异性结合情况，结合基因过表达和干扰技术，评估c-Myc对miRNA的直接转录激活作用;基因过表达和干扰技术观察甲素重要靶基因与ERCC3与c-Myc之间的相互调控作用。
　　 4、收集30例新鲜人肝癌组织样本及临床资料，qRT-PCR技术检测人肝癌组织内c-Myc、miR-17及miR-93的表达情况，后两者分别是miRNA-17-92和miRNA-106b-25的代表性成员，分析c-Myc表达水平是否与miR-17、miR-93的表达具有相关性;根据miR-17或者miR-93的表达水平将肝癌病人分为高表达组和低表达组，比较两组患者间的无复发生存期及总生存期是否有差异，以明确这两种miRNA表达异常是否影响肝癌患者的预后。
　　 结果:
　　 1、甲素能够显著抑制多种肝癌细胞的增殖，并且该效应呈时间和剂量依赖性。
　　 2、甲素能够在体外显著诱导多种肝癌细胞发生凋亡，且该效应亦呈剂量依赖性。甲素能够诱导HepG2细胞内caspase-3及PARP的活化，上调Bax/Bcl-2比例，激活线粒体相关凋亡途径，同时能提高P53的表达和磷酸化水平，抑制Akt的表达和磷酸化。甲素对肝癌细胞的周期分布无显著影响。
　　 3、甲素能够显著抑制裸鼠肝癌皮下种植瘤的生长，且对裸鼠的肝肾功能无显著影响。我们利用HepG2-luc细胞建立了裸鼠荷瘤模型，将裸鼠分为阴性对照组、甲素给药组和阳性对照组。相对于阴性对照，甲素和顺铂给药组的肿瘤生长速度及体积显著降低，且甲素给药组降低更明显。TUNEL实验表明，甲素给药组和顺铂给药组裸鼠瘤体内均发生了显著的细胞凋亡。
　　 4、甲素能够通过抑制转录因子c-Myc的转录活性，同时下调miR-17-92及miR-106b-25簇内多个成员的表达。我们首先利用miRNA芯片检测甲素对HepG2细胞内miRNA表达谱的改变，发现200nM甲素刺激24h后HepG2细胞内miRNA表达谱显著改变，超过80％的miRNA表达下降。我们进一步利用生物信息学方法筛选出显著性差异miRNA，在前十位高丰度差异miRNA中，有2种miRNA上调，8种下调，在8种下调的miRNA中有5种分别属于miRNA17-92及miR-106b-25簇。我们证明c-Myc能够直接与miR-106b-25宿主基因MCM-7的5'端上游序列CACGTG特异性结合，从而促进miR-106b-25的转录。另外已知c-Myc也能够与miR-17-92上游调控序列结合促进其表达，我们进一步证明甲素通过下调c-Myc的转录活性同时下调miR-17-92及miR-106b-25簇内多个成员的表达，导致其共同的靶基因PTEN及BIM表达升高，而后二者均具有较强的促凋亡作用，最终促进HepG2细胞发生凋亡。我们又分别构建miR-17-92及miR-106b-25真核表达质粒，同时转染至HePG2细胞内，发现二者过表达后能够显著拮抗甲素的诱导凋亡作用，证明甲素对miR-17-92和miR-106b-25的抑制作用能够促进肝癌细胞的凋亡。
　　 5、甲素通过抑制靶分子ERCC3的表达抑制c-Myc的表达和转录活性。Western-blot及qRT-PCR实验结果表明，甲素能够显著下调HepG2细胞内ERCC3的转录和蛋白表达水平。报告基因检测结果表明，甲素在较低浓度下(25nM)即能显著抑制c-Myc的转录活性。我们构建ERCC3过表达质粒并转染HepG2细胞，发现过表达ERCC3后能够显著逆转甲素对c-Myc的抑制作用，证明甲素至少部分通过抑制靶分子ERCC3的表达而下调c-Myc的表达。更为有趣的是，我们分别过表达或者干扰ERCC3和c-Myc，发现过表达c-Myc后ERCC3表达上调，干扰c-Myc后ERCC3表达下调，反之亦然。由此，我们猜测c-Myc和ERCC3能够相互促进对方的表达，二者构成一个正反馈系统。
　　 6、miR-17和miR-93在人肝癌组织内异常高表达，二者的表达水平高低与患者的无复发生存期及总生存期呈负相关。我们收集了30例新鲜人肝癌组织样本及临床资料，利用qRT-PCR技术检测人肝癌组织内c-Myc、miR-17及miR-93的表达情况。结果表明，c-Myc表达水平与miR-17、miR-93的表达具有正相关性，三者均在大部分肝癌组织中呈高表达状态;我们根据miR-17或者miR-93的表达水平将肝癌病人分为高表达组和低表达组，发现miR-17或者miR-93高表达组患者无复发生存期显著缩短，两组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:综上所述，我们发现甲素在体内外具有显著的抗肝癌效应，且该效应与甲素对肝癌细胞内c-Myc/miRNA簇/靶基因的调节作用有关。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一部分 甲素体内外抗肝癌效应的实验研究

一、材料与方法

二、实验步骤和方法

三、结果

四、小结

第二部分 甲素对HepG2细胞内miRNAs表达的调节作用及机制研究

一、材料、试剂和仪器

二、实验步骤和方法

三、结果

四、小结

第三部分 miRNA表达与肝癌临床病理特征的关系

一、材料、试剂和仪器

二、实验步骤和方法

三、实验结果

四、小结

全文小结

参考文献

附录

雷公藤甲素药理作用靶分子研究进展

致谢