感染人的新型梨形虫病原体的动物感染,形态学及分子生物学鉴定

摘要

梨形虫(Piroplasma)属顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa)、梨形虫目(Piroplasmida),对人畜健康影响较大的蜱传种类分别属于巴贝虫属(Babesia spp.)和泰勒虫属(Thelieria spp.),可引起梨形虫病[1],由于过去梨形虫曾译为“焦虫”,故梨形虫病又被称为“焦虫病”,也曾称“红细胞住血原虫(hematocytozoon)”[2]。
　　 梨形虫经由蜱传播,在宿主体内的主要形态呈圆形、梨形、杆形、椭圆形、逗点形或阿米巴形等形态,具有顶复细胞器。有性生殖和孢子增殖是在无脊椎动物宿主体内进行,在脊椎动物宿主体内进行无性生殖。梨形虫病一般呈急性过程,通常表现为贫血、血红蛋白尿和黄疸,具有明显的季节性和地区性,巴贝虫是人和动物巴贝虫病的病原,而泰勒虫是动物泰勒虫病的病原[3-6]。一般认为,泰勒虫不感染人类。梨形虫病在世界各地流行,死亡率高,给畜牧业和国民经济造成重大损失[1]。
　　 梨形虫的鉴定与分类主要有传统分类学和分子分类学两种方法[7]。传统分类学依据所寄生的宿主、形态、发病动物临床症状等进行分类,但由于病原形态的多变性,生活史较难追踪,传播媒介多样性,种种因素使传统分类学存在一定的局限[8]。随着分子生物学技术的发展,核酸扩增方法在梨形虫的分类鉴定有着决定性的作用。
　　 本研究将取自有临床症状的病人带虫血液分别对四种动物(昆明鼠,Balb/c小鼠,沙鼠,新西兰兔)进行感染,感染后定期取血观察血液内病原体的形态特征,并观察超微结构,从形态学上对该梨形虫进行鉴定。在该梨形虫在动物体内的感染量达到峰值的时候,取动物血液提取DNA,扩增梨形虫18S rRNA,对该梨形虫进行分子生物学鉴定。
　　 在动物血液涂片的观察中发现,该梨形虫在白细胞内细胞核周围呈密集的点状,类似嗜碱性白细胞。在红细胞中可以观察到梨形、椭圆形、逗点状的外观形态。与巴贝虫和泰勒虫的形态[9,10]对比有相似之处,具有泰勒虫的特征,即白细胞内裂体增殖,提示该病原体有可能是泰勒虫相关种类。
　　 根据文献报道,合成四条针对巴贝虫、泰勒虫18S rRNA的通用引物进行半巢式多重PCR,三次PCR扩增的片段均与泰勒虫具有更高的同源性,对PCR产物经克隆测序364bp序列比对,与泰勒虫18S rRNA同源性达到99％。
　　 但是,在多次重复的PCR中,也出现克隆序列与Colpodella序列84％同源性。而我国学者也在发热病人血液中扩增到Colpodella相似序列,Colpodella是一种与其它顶复门原虫(包括疟原虫及梨形虫)具有并列进化关系的自由生活原虫[11]。
　　 本研究所鉴定梨形虫取自病人血液,通过传统形态学鉴定与分子生物学鉴定相结合,从动物外周血白细胞中发现裂殖体,提示该虫具有泰勒虫的形态特征。综合多次PCR及测序结果,扩增序列与泰勒虫和Colpodella的相似程度高于巴贝虫,说明该病原体是巴贝虫的可能性小于前两种虫。迄今为止,寄生虫学研究认为,巴贝虫可以感染人和动物,泰勒虫仅在动物中发现,但从NCBI的GenBank中搜索到一个泰勒虫的序列是从发热病人血液扩增得到的[12];Colpodella相似的序列也有从人体扩增的报道。这种现象尚难以解释,不能确定是几种病原体的混合感染,还是一种尚待认知的新虫种。泰勒虫和巴贝虫属于顶体复合物门,而Colpodellids门则是与顶体复合物门相近的一个姊妹世系(sister lineage),因而,该病原体的分类地位可能在囊泡虫总门(Alveolata)。其确切的分类地位有待进一步鉴定。
　　 本本研究对一种未知人体寄生原虫的鉴定,其结果对该新病原体的认知又进了一步,对于未知梨形虫病的防治积累基础理论,对临床中的未知原虫感染患者提供了相应的鉴别方法,也为人群中该病的流行病学调查奠定了基础,对防治该新出现的血液感染性病原体具有重要的意义。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 建立梨形虫的动物感染及形态描述

一、研究背景

二、材料与方法

三．结果

四、讨论

第二部分 梨形虫新型种的分子生物学鉴定

一、研究背景

二、材料与方法

三 结果

四、讨论

小结和展望

参考文献

综述

在读硕士学位期间的科研情况

致谢