结核病血清学诊断试剂盒的研究

摘要

目的：提取纯化结核分枝杆菌(MTB)特异性抗原,建立规范的MTB特异性抗体酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)及斑点免疫渗滤试验(dotimmunofiltrationassay,DIGFA)检测系统。用建立的检测系统检测血清中的抗结核抗体,评价其在结核病(TB)血清学检测中的应用价值。
　　方法：以实验室现有的重组MTB蛋白库为基础,表达纯化11种具用应用前景的MTB重组蛋白并提纯1种天然MTB脂多糖抗原(MTB-LPS);分别确定各抗原最佳包被浓度和最佳第二抗体稀释度,建立规范的ELISA检测系统,用建立的。
　　ELISA检测系统检测192例结核血清,68例非TB患者血清,210例健康人血清共470份血清标本中的抗结核抗体水平,并比较在不同的阳性界值下各种抗原对TB检测的灵敏度及特异度的差别,以此筛选出敏感性好、特异度高、互补性强的抗原进行组合,并评价该组合在TB血清学诊断中的价值。以该抗原组合为基础建立胶体金免疫渗滤检测系统并对检测120例结核血清,60例非TB患者血清,60例健康人血清共240例血清标本进行检测,同时以目前已获得临床批文、国内应用广泛的MTB抗体胶体金法诊断试剂盒(上海奥普生物医药有限公司生产)作为参比试剂进行对比试验,评价该免疫胶体金渗滤试剂盒在TB诊断中的应用价值。
　　结果：
　　1、经亲和层析后得到了11种纯度较高的MTB重组蛋白,提纯的MTB脂多糖抗原未见核酸及蛋白残留。
　　2、获得优化的ELISA检测条件:辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG最佳稀释度为1:10000,重组蛋白最佳包被浓度在1.6-6.3ug/ml之间,脂多糖抗原最佳包被浓度为0.16ug/ml。并应用ELSA检测系统检测了470例血清标本中抗结核抗体水平,以ROC曲线计算出最佳临界点作为界值,12种抗原的灵敏度分别为60.5％至82.9%,特异度分别为64.1%至92.7%;以?x±3SD作为界值,12种抗原的灵敏度分别为13.3%至40.5%,特异度分别为96.4%至99.5%。
　　3、各抗原之间存在一定的相关性和互补性,不能互相替代;将具有较强互补作用的r38kD、MTB-LPS、r16kD、rMPT63四种抗原进行组合过程中,随着组合抗原数的增多,检测灵敏度由29.0%提高至65.2%,特异度仅由96.9%降至90.0%。
　　4、制备了以r38kD、MTB-LPS、r16kD、rMPT63四种抗原为基础的免疫胶体金渗滤试剂盒。240例血清标本的检测结果显示,本文制备的免疫胶体金渗滤试剂盒与MTB抗体胶体金法诊断试剂盒(上海奥普生物医药有限公司)相比,二者在肺结核组及健康对照组两个组别中的检测结果无显著性差别,但在非结核疾病组的检测中,本文的胶体金渗滤检测试剂盒要优于对照试剂盒。
　　结论：
　　1、成功地制备了12种用于TB血清学检测的抗原,并在此基础上成功地建立了ELISA和DIGFA检测系统。ROC曲线计算出最佳临界点作为界值各抗原的灵敏度较以?x±3SD作为界值的灵敏度高,但特异性略低;由于各抗原在灵敏度及特异度上都存在着互补性,随着组合抗原的增加,检测灵敏度提高的同时,特异性会显著降低。因此,在组合抗原检测过程中,选择?x±3SD作为界值更为适合。
　　2、本文制备的胶体金检测试剂盒与传统的抗酸杆菌染色法(痰涂片法)相比,在灵敏度方面有明显的优势;与目前已获得临床批文、在国内广泛应用的MTB抗体胶体金法诊断试剂盒相比,在特异度方面明显优于对照试剂盒,灵敏度与对照试剂盒比较无显著性差别。

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缩略词表

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英文摘要

前 言

参考文献

第一部分 MTB脂多糖和重组蛋白抗原的制备

材料与方法：

结果

讨论

参考文献

第二部分 12种结核分枝杆菌抗原血清学诊断价值的研究

材料与方法：

结果

讨论

参考文献

第三部分 结核分枝杆菌四种抗原组合在免疫胶体金实验中

材料与方法

结果

讨论

参考文献

研究结论

综述

五、参考文献：

结核分枝杆菌12种抗原在结核病血清学诊断中的研究

4.参 考 文 献

个人简历

致谢