济泰片药效物质基础及药代动力学研究

摘要

济泰片来源于清代道光、同治年间独创的戒断鸦片毒瘾的秘方，已被国家食品药品监督管理局(SFDA)批准可用于阿片类药物成瘾的脱毒治疗。济泰片由十五味药材（延胡索、丹参、当归、川芎、桃仁（炒）、红花、附子（制）、人参、肉桂、干姜、豆蔻、洋金花、沉香、木香和珍珠粉）以一定比例按君、臣、佐、使配伍而成。其中延胡索、丹参为君药，起到活血行气、止痛安神的作用;人参、川芎、当归、附子（制）等共为臣药，珍珠粉为佐药，洋金花为使药。临床研究表明，济泰片在戒毒治疗过程中，可显著改善和缓解脱毒戒断症状，且能显著提高患者机体免疫功能，加速患者身体戒断后的康复进程。虽然济泰片的临床疗效显著，但其发挥作用的主要物质、作用机制及其本身的质量控制标准的研究尚存在较大差距。“多成分、多靶点、多途径的整合作用”是中药复方治疗疾病的主要特点。济泰片的组成化学成分尚不清楚，体内作用的物质基础尚不明确以及药效物质基础体内作用的规律尚未阐明，这些基础研究的欠缺，无法为济泰片临床疗效提供科学依据，从而限制了济泰片的产业化与国际化。
　　 本研究选择疗效确切的戒毒中药“济泰片”为研究对象，综合运用各种创新理论及先进的技术手段，从济泰片中主要化学成分、入血成分及入脑成分的识别等几个方面阐明济泰片药效物质基础;同时，对其药效物质基础的体内动态变化过程进行研究，为济泰片的临床药物监测和用药安全提供科学依据。具体研究内容如下:
　　 首先，采用高效液相色谱串联二极管阵列检测器/电喷雾质谱法(HPLC-DAD/ESI-MS/MS)对济泰片中主要化学成分进行全面系统的表征。在对标准品母离子碎片离子的裂解规律进行分析基础上，通过对图谱中各化合物的保留时间，紫外(UV)和质谱图谱与标准品及相关文献比较，最终共鉴定了济泰片中包括生物碱类、酚酸类、丹参酮类、黄酮类、氰苷类、人参皂苷类、2-[2-苯乙基]色原酮类、苯酞内酯类及姜酚类化合物在内的101个化学成分，并对九类化合物的特征性裂解规律进行了总结和分析研究。在正离子模式条件下，莨菪类生物碱的裂解规律主要表现为中性丢失C9H10O3和C9H8O2单元。氰苷类化合物主要表现为中性丢失苯乙醇腈单元。卓鎓离子与C4H2O单元是2-[2-苯乙基]色原酮裂解中的特征性碎片，其形成过程主要为C环的RDA裂解。本研究首次对济泰片的化学成分进行了系统整体研究，建立的方法可以快速、有效地确定济泰片中主要化学成分，为济泰片的质量评价和药效物质基础研究提供大量化学信息和有力的技术支持。
　　 在对济泰片中化学成分全面定性的基础上，本研究利用“血清药物化学理论”结合HPLC-DAD/ESI-MS/MS技术对济泰片入血成分进行了定性分析。SD大鼠灌胃给予济泰片1h后，肝门静脉取血，高速离心取上清。血清样品经甲醇沉淀后进行LC-MS分析。采用Waters XTerra C18色谱柱，以乙腈-水（0.1％甲酸）梯度洗脱，在正负离子模式下分别采集其质谱信息。通过综合比较分析济泰片提取液、给药大鼠血浆及空白大鼠血浆的提取离子流色谱图，并与标准品及文献数据比对，首次鉴定了济泰片中26个原型入血成分及5个代谢产物，包括6个人参皂苷类，5个生物碱类，5个苯酞内酯类，3个酚酸类，2个丹参酮类，2个氰苷类，2个姜酚类及1个查耳酮类化合物，代谢产物分别是延胡索乙素葡萄糖醛酸结合物、乙酰基丹参素、6-姜酚葡萄糖醛酸结合物、氢化丹参酮ⅡA葡萄糖醛酸结合物、氢化去氢丹参酮ⅡA的葡萄糖醛酸结合物。本研究首次建立了一种快速筛选大鼠口服济泰片后入血成分的整体方法，并且本研究检测的部分入血成分与相关戒毒活性的报道一致。该方法的建立不仅有助于阐释济泰片的入血成分，而且为济泰片药代动力学研究提供标志性化合物。
　　 济泰片主要用于阿片成瘾的脱毒治疗，其作用的靶部位主要为中枢神经系统，本章采用脑脊液药物化学的理论与方法，结合快速液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF-MS/MS)技术对大鼠灌服济泰片后入脑成分进行了全面的定性分析。通过比较空白脑脊液、给药脑脊液及济泰片提取液中化学成分的差异，首次鉴定了包括生物碱类和苯酞内酯类在内的11个原型成分和3个代谢产物。同时采用快速液相色谱串联三重四级杆质谱(RRLC-QqQ-MS/MS)技术对已鉴定的部分化合物进行目标性检测，并定量了给药大鼠脑脊液中的6个成分，各成分的含量分别为:东莨菪碱1.678 ng/mL，四氢小檗碱0.024 ng/mL，四氢黄连碱0.014 ng/mL，原阿片碱0.162ng/mL，延胡索乙素0.587 ng/mL及延胡索甲素0.051 ng/mL。结果表明，生物碱类和苯酞内酯类成分为济泰片作用于中枢神经系统的主要活性成分，与相关文献报道一致。本研究建立了一种快速、灵敏、准确检测中药复方体内的极微量成分的方法，为中药复方药效物质基础研究提供有力的技术支持，筛选到的目标成分可以作为作用机制研究的标志性成分。
　　 在前述研究基础上，本章对济泰片的主要成分体内药代动力学行为进行了探讨。SD大鼠经灌胃给予济泰片15 g/kg大鼠体重，于24 h内采集不同时间点大鼠血浆。分别定量血浆中的四个生物碱（四氢黄连碱、四氢小檗碱、延胡索乙素及延胡索甲素）及六个酚酸类（丹参素、阿魏酸、丹酚酸A、丹酚酸B、苦杏仁苷及羟基红花色素A）化合物。血浆样品经乙腈沉淀蛋白预处理，以药根碱和没食子酸作为内标，采用亚微米粒径(1.8μm)分析柱结合RRLC-QqQ-MS/MS的多反应监测模式，分别在正离子模式下对血浆中叔铵型生物碱，与负离子模式下血浆中酚酸类成分进行监测。针对上述不同类型化合物分别采用不同的分析柱与质谱采集模式，通过对样品前处理条件、液相条件及质谱条件的优化，最终分别实现正离子模式下单针8 min对血浆中4个生物碱的监测，及负离子模式下单针7 min对其余成分的监测。四氢黄连碱、四氢小檗碱、延胡索乙素及延胡索甲素的最低检测限分别为2.0 ng/mL、0.2 ng/mL、1.0 ng/mL及0.4ng/mL，而苦杏仁苷、丹参素、阿魏酸、羟基红花色素A、丹酚酸A及丹酚酸B的最低检测限分别为7.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL及4.0 ng/mL。目标分析物的平均回收率范围从85.51％-93.99％，日内和日间精密度均处于1.21-4.73％的范围内。其最低定量限、精确度、准确度、回收率与基质效应均满足FDA对生物样本分析的要求。研究发现四种生物碱虽然具有相似的结构，但其体内药代动力学参数却表现出明显的不同，但都出现双峰现象。丹参素、阿魏酸、丹酚酸A及丹酚酸B的药代动力学参数中可看出各化合物在吸收和消除行为中均存在明显差异，这可能与化合物不同的理化性质及复方中化学成分相互作用相关。
　　 关健词:济泰片;血清药物化学;脑脊液药物化学;药代动力学;液相串联质谱法

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、研究背景

(一)毒品滥用概况

(二)毒品滥用的西药治疗现状

(三)毒品滥用的中医药治疗现状

二、戒毒中药济泰片研究进展

(一)药效物质基础及作用机制研究

(二)质量标准研究

三、中药物质基础研究的理论基础及技术手段

(一)中药复方物质基础研究的理论基础

(二)中药复方物质基础研究的技术手段

四、本课题研究思路及内容

(一)研究思路

(二)研究内容

参考文献

第一章 济泰片主要化学成分研究

一、实验材料

(一)仪器

(二)药品与试剂

二、实验方法

(一)济泰片提取液的制备

(二)标准品溶液配制

(三)色谱条件

(四)质谱条件

(五)数据处理与分析

三、结果与讨论

(一)提取条件优化

(二)色谱条件优化

(三)质谱条件优化

(四)济泰片标准品的ESI-MSn裂解分析

(五)济泰片各类型化合物鉴定

四、小结

参考文献

第二章 济泰片血清药物化学研究

一、实验材料

(一)仪器

(二)药品与试剂

(三)实验动物

二、实验方法

(一)样品制备

(二)分析条件

三、结果与讨论

(一)样品前处理优化

(二)济泰片提取液和血样质谱图分析

(三)济泰片原型成分鉴定

(四)济泰片代谢产物鉴定

四、小结

参考文献

第三章 济泰片脑脊液药物化学研究

一、实验材料

(一)仪器

(二)药品与试剂

(三)实验动物

二、实验方法

(一)样品制备

(二)液相条件

(三)质谱条件

(四)动物实验

(五)样品前处理

(六)数据的采集、处理与分析

三、结果与讨论

(一)液相条件优化

(二)质谱条件优化

(三)动物实验优化

(四)济泰片提取液、空白脑脊液及给药脑脊液质谱图分析

(五)济泰片脑脊液中原型成分鉴定

(六)济泰片脑脊液中代谢产物的鉴定

(七)济泰片脑脊液中目标成分的定量研究

四、小结

参考文献

第四章 济泰片主要活性成分药代动力学研究

第一节 济泰片生物碱类成分药代动力学研究

一、实验材料

二、实验方法

三、结果与讨论

四、本节小结

第二节 济泰片酚酸类成分药代动力学研究

一、实验材料

二、实验方法

三、结果与讨论

四、本节小结

参考文献

结语

在读期间发表论文

致谢