自动捕获内皮祖细胞促进血管化的新型皮肤替代物的实验研究

摘要

研究背景：
　　 随着皮肤组织工程研究的进展，从表皮、成纤维细胞的培养与移植到真皮支架的研制与应用技术已较为成熟，各种人工皮肤产品也相继问世，尤其是各种真皮替代物成功应用于临床并收到了良好的修复效果。在此基础上，有研究者将皮肤种子细胞复合真皮支架构建了含表皮细胞、成纤维细胞的活性皮肤替代物，试图一次性修复缺损的表皮层和真皮层，然而，其不仅构建时间长，程序复杂，而且移植后血管化慢、存活率低，限制了其临床应用，因此寻找一种快速构建皮肤替代物并促进其血管化的方法成为皮肤组织工程研究中亟待解决的难题。
　　 目前组织工程皮肤的制备主要基于传统的二维培养模式，常规方法需要首先扩增足量的细胞后，再接种于真皮支架上进行2-3周的培养才能完成构建，其不仅耗时长，不能及时满足临床需要，而且长时间的培养容易导致细胞老化、增殖活性降低。三维培养方式及微载体培养技术的出现为解决贴壁依赖型细胞的大规模快速培养提供了有效方法，现已广泛地应用于生物制药领域。前期研究中我们将人胎盘来源的羊膜制备为羊膜微粒，发现其不仅具备良好的组织相容性适宜作为真皮支架，而且以其作为微载体能够快速扩增表皮干细胞。因此，本研究拟在上述研究的基础上以羊膜微粒作为真皮支架，采用三维培养技术提供一种快速构建活性真皮替代物的方法。
　　 促进皮肤替代物血管化一直是皮肤组织工程研究的热点。目前研究者主要采用真皮支架连接血管生成相关因子或进行体外构建微血管样结构的方式，这些方法均存在一定的局限性，因为新生血管形成需多种因子、细胞外基质及相关细胞的共同参与，单一的调控因素效果并不理想。此外体外构建内皮化的皮肤替代物虽具有一定应用前景，但操作难度大，技术条件要求高，难以广泛推广。最近研究表明，存在于外周循环血液中的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPC)是新生血管形成的关键参与者，其不仅直接参与缺血组织的干细胞血管发生，而且通过分化为内皮细胞参与局部新生血管形成过程。然而，由于分离、培养自体EPC的方法尚未成熟，使EPC的应用受到极大的限制。最新研究发现基质细胞衍生因子-1α(Stromal cell-derived factor-1alpha，SDF-1α)是EPC的强大趋化剂，它通过与EPC表面的特异性受体CXCR4(chemokine CXC receptor type4，CXCR4)结合，在短时间内即可迅速动员骨髓中EPC进入外周血，并介导外周血中的EPC迁移、归巢到缺血缺氧组织局部，参与血管新生及损伤血管的再内皮化。
　　 本研究设想，利用SDF-1α对EPC的强大趋化作用，以羊膜微粒作为真皮支架，结合三维旋转培养系统，设计一种能自动捕获外周血中EPC并快速构建活性真皮替代物的方法。
　　 研究方法：
　　 1.SDF-1α质粒构建与慢病毒包装
　　 1.1重组质粒构建
　　 利用cDNA文库，以PCR方法获取目的基因，将目的基因SDF-1α与pGC-FU载体融合获得重组质粒。再将目的质粒转染至293T细胞， Western Blot检测转染293T的样品。
　　 1.2 SDF-1α-LV慢病毒包装
　　 将带有GFP荧光且过表达SDF-1α的重组质粒和辅助原件质粒共转染至293T细胞获得慢病毒浓缩液，利用Real Time-PCR法对不同浓度病毒感染后样品组的CT值及表达量进行分析，检测病毒滴度。
　　 2.SDF-1α慢病毒转染成纤维细胞
　　 2.1转染效率评价
　　 预实验确定适合的MOI值，SDF-1α-LV转染人皮肤成纤维细胞获得SDF-1α过表达成纤维细胞（SDFovHDF），荧光显微镜下观察细胞转染后绿色荧光表达情况，流式细胞术检测病毒转染效率。
　　 2.2目的基因及蛋白表达测定
　　 Realtime-PCR检测目的基因表达情况，ELISA检测转基因细胞培养上清中目的蛋白含量。
　　 3.EPC趋化、迁移实验
　　 采用Transwell共培养小室迁移实验及划痕实验，评价SDFovHDF对EPC的趋化、迁移作用的影响。
　　 4.构建活性真皮替代物
　　 以羊膜微粒作为真皮支架，SDFovHDF为种子细胞，利用三维旋转培养体系构建含成纤维细胞的活性真皮替代物。荧光显微镜、扫描电镜观察成纤维细胞粘附增殖情况。
　　 5.活性真皮替代物移植全层皮肤缺损创面
　　 以C57BL鼠全层皮肤缺损创面为动物移植模型，将构建好的含成纤维细胞的真皮替代物移植创面，定期检测外周血EPC数量，测定创面愈合率，并行组织学检测、血管化评价。
　　 研究结果：
　　 1.慢病毒转染成纤维细胞鉴定
　　 SDF-1α过表达质粒测序结果正确，慢病毒滴度均在2.00E+8 TU/ml，MOI值为20时可获得理想的感染效率。
　　 流式细胞术检测成纤维细胞感染率均在90％以上。病毒感染后5天镜下观察，可见SDFov HDF组阳性信号集中于胞浆中，GFP-HDF组细胞整体均发绿色荧光。RealTime-PCR结果显示，SDFov HDF组mRNA表达量相对未感染组为5.3倍。ELISA检测转染细胞培养上清SDF-1α表达量为173±6pg/10(')6个细胞，GFP-HDF组未检测到。
　　 2.SDFov HDF细胞对EPC的迁移、趋化效果
　　 Transwell共培养小室迁移实验表明，三组细胞(SDFov HDF组、GFP-HDF组及HDF组)趋化的内皮祖细胞数量分别为为392±27个/视野，204±17个/视野(p＜0.01)，181±17个/视野(p＜0.01)，表明SDFov HDF对EPC具有明显的趋化作用。
　　 划痕实验表明SDFov HDF组培养上清可显著增强EPC的迁移能力，在24h内细胞迁移数量为72±8.3个，明显高于HDF组41±5.7个(p＜0.01)及DMEM组38±6.7个(p＜0.01)。
　　 3.构建活性真皮替代物
　　 培养24h观察即可见微型真皮替代物表面成纤维细胞形态良好，呈三维立体生长，此后细胞逐渐增殖，培养5-7d即可见细胞布满微粒表面，部分微粒间相互粘连成团。
　　 扫描电镜可见细胞密集粘附于羊膜微粒表面，细胞形态饱满呈梭形，部分微粒呈球形卷曲。
　　 4.活性真皮替代物移植促进创面修复
　　 移植后3、5、7天测定小鼠外周血EPC显示，SDFov HDF组EPC百分比明显高于其他组(p＜0.01)。免疫组化检测发现SDFovHDF组血管化明显，血管密度明显高于其他组(p＜0.01)。Western Blot检测3d、5d、7d、10d创面SDF-1α含量发现SDFovHDF-mAM组显著高于其他实验组。
　　 计算创面愈合速度表明SDFov HDF组愈合时间为17.25±0.7天，明显快于HDF微粒组18.5±1.2天(p＜0.01)、空白微粒组18.87±1.1天(p＜0.01)。创面愈合后观察可见微粒移植组创面愈合平整、柔软，收缩程度轻。组织学检测可见微粒填充作为真皮基质，表皮复层较厚。
　　 研究结论：
　　 1、利用过表达SDF-1α基因的方法，成功构建了一种自动捕获内皮祖细胞促进皮肤替代物血管化的新方法，摒弃了常规采用体外培养、扩增内皮祖细胞，然后种植于真皮支架中进行移植的传统模式，为促进组织工程皮肤血管化提供了新思路。
　　 2、采用羊膜微粒作为真皮支架，结合旋转培养系统可高效快速构建含成纤维细胞的活性皮肤替代物，改善了传统二维培养构建皮肤替代物的方式。

目录

声明

摘要

英文缩略语说明

前言

参考文献

课题设计

材料和方法

一、材料

二、实验方法

实验结果

一、慢病毒转染成纤维细胞鉴定

二、SDFovHDF细胞对EPC的迁移、趋化效果

三、构建含SDFovHDF的微型真皮替代物

四、移植全层皮肤缺损创面

分析与讨论

参考文献

实验结论

综述

在读期间论文发表、获奖情况

致谢