趋化-捕获内皮祖细胞促进移植脂肪血管化的实验研究

摘要

背景：自体脂肪移植已有近百年历史。但因为游离脂肪细胞移植早期未建立有效血供而导致移植脂肪大量坏死。如何能有效促进移植脂肪血管化进而提高其成活率成为整形外科医生困扰已久的问题。近些年各种研究大部分集中在添加各种细胞因子，通过调控血管生长因子达到促进血管化的目的。然而参与新血管形成并非单一的调控环节，需要多种细胞因子及相关细胞共同参与、相互作用。CAL技术即在游离脂肪细胞移植技术中添加ADSCs，ADSCs可分泌多种细胞因子及生长因子，在一定程度上提高了移植脂肪成活率，但距离理想的高成活率仍具有一定差距。目前EPC作为内皮细胞的前体细胞，参与血管的生理性及病理性形成。然而生理状态下外周血EPC数量极少。体外既使能培养、扩增足量的EPC，但长时间培养后容易导致干细胞分化而失去血管生成能力。大量研究表明，EPC可被基质细胞衍生因子1a（SDF-1a/CXCL12）趋化，通过SDF-1a与CXCR4受体结合激活传导通路，迅速动归巢到局部作为主要细胞成分参与血管新生及血管内皮修复。目前国内外有应用SDF-1a作为趋化剂趋化EPC促进血管修复及再通的研究，但尚未见通过应用SDF-1a修饰的脂肪干细胞体内定向趋化EPC促进移植脂肪血管重建的研究。
　　目的：1、脂肪干细胞获取、鉴定及细胞生长特性研究。2、CXCL12慢病毒载体的构建、转染脂肪干细胞的可行性研究及目的蛋白的表达检查。3、过表达目的蛋白CXCL12的脂肪干细胞在体内对EPC的趋化-捕获作用。4、趋化-捕获的EPC对移植脂肪组织的成血管作用及对移植脂肪成活率的影响。
　　材料与方法：1.ADSCs的分离培养及鉴定：取临床吸脂术抽吸脂肪，离心过滤后获取原代ADSCs培养，流式细胞仪检测细胞表面抗原及成脂、成骨诱导分化进行鉴定。2.CXCL12慢病毒载体构建、转染ADSCs并检测目的蛋白的表达：PCR法与慢病毒系统包装病毒并转染ADSCs，Western-blot检测ADSCs目的蛋白的表达。3.脂肪移植模型的制备及分组：将A、B、C、D四组移植物随机注入裸鼠背部皮下：A组为CXCL12转染的ADSCs与脂肪组织混合物;B组为慢病毒空载体转染的ADSCs与脂肪混合物;C组为正常ADSCs与脂肪混合物;D组为培养基与脂肪混合物。4.EPC的趋化-捕获情况观察：术后第2、4、7、14、30天，测外周血EPC数量;western-blot法检测移植物目的蛋白表达情况。5.移植物成血管情况观察及对移植脂肪成活率的影响观察：第2、4、7、14、30天免疫组化切片成血管形成情况的观察：(1)各组各时间段新生成血管计数;(2)90天组移植物湿重测量;(3)90天移植物“点计数”液化坏死及纤维化程度。6.统计分析。
　　结果：1.分离培养的ADSCs形态、成脂、成骨诱导，及流式细胞仪检测均符合脂肪干细胞特性。2.构建的目的基因载体成功转染ADSCs，筛选后扩增细胞，检测到转染后的ADSCs高表达目的蛋白SDF-1a。3.第2、4、7、14、30天检测外周血单核细胞EPC明显高于B、C、D组;移植组织目的蛋白表达明显高于B、C、D组。4.A组脂肪移植物血管形成早于其他组，且血管形成数量多于其他组;5.移植物90天称重A组平均湿重最大;组织病理切片显示A组脂肪组织存活最多。
　　结论：1.ADSCs来源丰富，提取方法成熟、操作简单，细胞具有多向分化能力，并可以分泌多种细胞因子，适合基因转染，作为目的基因载体具有优势。2.目前慢病毒载体构建技术成熟、高校，构建的过表达SDF-1a的ADSCs在裸鼠体内可长期稳定表达目的蛋白。3.在体内ADSCs表达的SDF-1a快速动员骨髓内的EPC进入血，并迁移至缺血缺氧的移植脂肪组织，促进移植脂肪早期血管网络的重建。4.在移植组织内过表达SDF-1a的ADSCs趋化的大量EPC进入促进移植脂肪早期血管网络重建，并明显提高移植脂肪成活率。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 人脂肪源间充质干细胞的分离培养及鉴定

材料与方法

结果

第一章附图

讨论

结论

第二章 CXCL12基因载体的构建、转染ADSCs及其表达

引言

材料与方法

结果

第二章附图

讨论

结论

第三章 脂肪移植血管化的动物实验研究

引言

材料与方法

结果

第三章附图

讨论

结论

全文小结

参考文献

综述 促进自体脂肪移植血管形成的研究进展

在读期间发表论文

致谢