移植自体骨髓源内皮祖细胞促进静脉桥血管再内皮化及抑制内膜增生的实验研究

摘要

动脉硬化的病理机制是以血管内皮损伤作为始动环节的，随后是巨噬细胞的粘附和浸润；平滑肌细胞向内膜迁移及过度增殖[1]。在血管成形术、支架置入及静脉移植术后出现的再狭窄都是由于内皮细胞的损伤和迅速的新内膜的形成(新内膜的主要成分是平滑肌细胞的过度增生)所致。尽管在病因及流行病学上有所不同，但动脉硬化和血管成形术、静脉移植后再狭窄都具有一个共同的病理生理学阶段：内皮细胞损伤及损伤后再内皮化。我们一直认为这个再内皮化的过程是由损伤临近部位血管壁的成熟的内皮细胞迁移和增殖分化的结果。但最近的研究结果表明参与这个再内皮化的细胞主要是来源于循环血池的内皮祖细胞。 1997年发现成熟个体外周血中存在血管内皮细胞的前体细胞——血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcellEPC)并且这种细胞可以在肌肉或心肌缺血的情况下被动员和集募到缺血的部位，分化成为成熟的内皮细胞参与后天的血管新生。近期系列研究则提示，体内循环血池中的EPC参与了损伤部位的内皮修复，而且EPC不仅可恢复内皮单细胞层结构，还可恢复其生物功能。在正常的生理状态下，外周血中EPC的量很少，但在一些细胞因子的作用下EPC的动员可以成倍的增多。 关于EPC细胞治疗缺血性疾病已有很多报道。最近研究表明应用他汀类药物可以增加骨髓EPC的动员，并且这些EPC可以整合到血管内皮的损伤部位，并参与再内皮化，促进颈动脉球囊损伤血管内皮的再内皮化及抑制新内膜的过度增生。 Kaushal等报道将离体猪髂内动脉血管内膜去内皮后，植入自体来源的EPC，观察到这段血管内皮再生并能恢复血管内皮生物功能。将这段血管植回动物的颈动脉，发现用EPC再内皮化的血管移植物可保持通畅130天，而无EPC接种的血管在15天内就发生栓塞。 从上述实验结果可以看出应用EPC细胞治疗血管损伤性疾病的前景。自体静脉移植(autogenousveingraft，AVG)是治疗冠状动脉及周围动脉缺血的重要方法。但移植后的内膜增厚及动脉粥样硬化形成所致的再狭窄严重地影响了远期的疗效。内皮细胞的损伤、脱落是静脉移植后再狭窄的一个重要原因，那么，自体EPC移植能否促进移植血管重构过程中损伤血管的再内皮化，以阻止新内膜的过度增生，值得我们做进一步研究。 本研究的目的：(1)建立兔左颈外静脉、颈总动脉移植的动物模型动态观察移植术后移植静脉内皮的变化、外周血中血管内皮祖细胞的数量的变化及动态观察移植静脉VEGF的蛋白表达、NOS活性变化，确立移植细胞的时间点；(2)兔骨髓来源的内皮祖细胞的体外扩增培养和鉴定；(3)观察移植自体骨髓来源的内皮祖细胞对移植血管内皮的作用。检测移植的细胞是否能整合到血管的损伤部位并对血管内皮有修复作用从而抑制内膜的过度增生，探讨保护静脉桥血管内皮的新途径。 首先，建立兔颈外静脉、颈总动脉移植的动物模型，动态观察移植手术后体内外周血中EPC的数量结果显示：于移植术后的1d可见外周血中EPC的数量开始增加(术前25±7.7；术后1d44.5±12.3)到术后3d外周血中EPC的数量达到峰值(63.9±6.8)，术后4d开始回落至术后7d(32.5±5.7)基本回落至术前水平。移植后1d组织学观察可见移植静脉内皮细胞有脱落，至术后3d，移植静脉内皮细胞已全部脱落，术后7d可见内皮修复但仍有缺损。移植术后1d移植静脉VEGF蛋白即呈阳性表达，并逐渐增加。不同时间点移植静脉NOS活性测定结果显示：从移植术后第三天开始移植静脉NOS活性明显降低 第二，兔骨髓来源的内皮祖细胞的体外培养及细胞鉴定，抽取兔骨髓，用密度离心法分离出骨髓单个核细胞，将骨髓单个核细胞调整适当密度接种于含有VEGF、bFGF等有利于向内皮细胞分化的生长因子的M199培养基中。用贴壁法分出EPC，每三天换液。观察细胞生长情况。将生长7天的细胞用BS-1及ac-DiL-LDL双染色鉴定，CDl33、CD34、FLK-1免疫荧光染色及用流式细胞仪检测鉴定，结果显示体外扩增法可成功地从骨髓中分离并扩增培养出一个具有EPC特征的细胞群体：FLK-1和CD133、CD34均阳性，能够摄取DiL-ac-LDL结合内皮特异性凝集素BS-1，同时这些细胞具有很强的增殖能力。并证实了抽取少量骨髓通过7d的体外扩增培养，每毫升骨髓可获得大约(1.5±0.36)×10。个细胞 第三，如第一部分建立自体静脉移植模型(分EPC组和PBS组)，对前面方法培养7天的自体骨髓来源的EPC用DAPI进行体外标记，于静脉移植术后3d将DAPI标记的EPC植入动物体内，于细胞植入后4d、2w、4w留取标本。用HE染色观察比较细胞植入后两组动物的血管内膜厚度，透射电镜下观察移植段血管的超微结构变化。扫描电镜移植静脉血管内皮变化。移植细胞的示踪：制成冰冻切片用Ⅷ因子抗体与血管内皮细胞特异性结合进行免疫荧光染色后在荧光共聚焦显微镜下观察，血管内皮细胞的胞浆为绿色荧光染色，植入的细胞核为兰色荧光。两组移植段血管内皮WesternBlot蛋白印迹法测定ICAM-1的表达。实验结果：EPC组内皮细胞的覆盖程度明显高于PBS组，且在EPC组的内皮层(绿色荧光)中可见分布不均匀的植入细胞(细胞核发兰荧光的)；EPC组的超微结构变化，平滑肌细胞多为收缩型而PBS组的平滑肌细胞多为分泌型。细胞植入4w，EPC组移植段血管内膜厚度明显低于PBS组(EPC组54.85±12.18μm；PBS组132.21±69.47μm(P＜0.05PBS组ICAM-1的蛋白表达经图像分析系统提示在细胞植入后4d高于EPC组(但无统计学意义)；以后两组ICAM-1的表达均有所增加，在细胞植入后2w，PBS组ICAM-1的蛋白表达显著高于EPC组；细胞植入后4w，EPC组的ICAM-1蛋白表达明显降低，PBS组ICAM-1蛋白表达虽也有所回落，但仍明显高于EPC组。 以上结果表明移植的自体骨髓来源的EPC可以整合至移植血管损伤的内皮，并促进移植血管的再内皮化，抑制血管内膜的过度增生。

目录

独创性声明及学位论文使用授权书声明

主要英文缩略词表

前言

第一部分 兔自体静脉移植模型的建立及静脉移植术后外周血EPCs数量的动态变化

第二部分 兔骨髓来源的内皮祖细胞的体外分离、培养及细胞鉴定

第三部分 植入自体骨髓来源的内皮祖细胞促进移植静脉血管的再内皮化及抑制内膜过度增生

小结

内皮祖细胞与移植性动脉硬化

致谢