miR-126-3p对移植静脉桥血管再内皮化及内膜增生的临床和基础研究

摘要

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病，coronary heart disease，CHD)是严重威胁人类健康、减低人类寿命的疾病之一，它是最常见的后天性心脏病。20世纪60年代出现的冠状动脉旁路移植术(冠脉搭桥，coronary artery bypass graft，CABG)，是现今治疗冠心病最安全、有效的手术方法之一。多个有关循环miR-126-3p临床研究发现，血液中miR-126-3p的表达与某些心血管疾病密切相关。稳定性心绞痛CAD患者血清miR-126-3p表达量较正常人降低，miR-126-3p表达量与致死心肌梗死发生呈正相关;2型糖尿病(diabetesmellitus，DM)患者血浆miR-126-3p表达下降与DM患者血管并发症的发生相关。目前，miR-126-3p在移植静脉血管桥衰败中的角色尚不清楚，miR-126-3p对移植桥血管内膜增生和再内皮化的研究尚未见报道。研究探讨miR-126-3p在移植静脉血管病变中的作用有着巨大理论的意义和广阔的临床的应用前景，并可能掀起CABG手术后防治移植桥血管衰败的治疗策略的巨大变革。
　　本研究可分为四部分。
　　第一部分 循环miR-126-3p在CABG患者手术前后表达变化及机制的临床研究
　　目的：检测CABG患者（严重冠心病需行CABG者）手术前后循环miR-126-3p表达水平变化以及与健康志愿者差异，检测离体培养的大隐静脉血管miR-126-3p表达动态变化，分析可能机制，为miR-126-3p参与CABG患者移植血管病变保护提供临床线索。
　　方法：收集健康志愿者与CABG患者术前血液标本，行RT-PCR检测血浆miR-126-3p的表达差异，比较健康志愿者与冠心病人在CABG术前的循环miR-126-3p表达差异。同时，收集冠心病患者行CABG术后1、3、7，14天血液标本，RT-PCR检测CABG患者手术前后miR-126-3p的动态表达变化。收集CABG患者术后剩余大隐静脉片段，对其行离体血管培养0，7，14天，行RT-PCR检测离体培养血管组织miR-126-3p动态表达变化。
　　结果：RT-PCR结果显示:CABG患者术前miR-126-3p表达量较正常人明显降低(P＜0.05)。CABG患者手术后miR-126-3p呈一过性升高，术后3天表达量最高，但与健康志愿者相比表达量仍明显降低。CABG患者术后7-14天左右miR-126-3p表达量逐渐恢复至术前水平。大隐静脉离体培养模型构建成功，RT-PCR结果显示，离体血管miR-126-3p表达呈动态变化，培养7天左右miR-126-3p表达量升高，培养14天左右时miR-126-3p表达量逐渐降低至未培养水平。
　　结论：严重冠心病患者血管病变可能与miR-126-3p表达量降低有关;冠心病患者CABG术后miR-126-3p的表达量升高可能与机体的代偿性作用有关;但这种代偿性升高是不完全的。提高miR-126-3p表达水平可能对移植桥血管有益，这需要进一步实验验证。
　　第二部分 miR-126-3p对大隐静脉细胞增殖和迁移功能的影响及相关机制的体外研究
　　目的：探讨miR-126-3p对大隐静脉内皮细胞(human saphenous vein endothelialcells，HSVECs)增殖和迁移功能的影响，并探讨可能机制及相关通路。平滑肌细胞的增生紊乱并迁移至内膜层以及ECM的沉积导致内膜增生。探讨miR-126-3p的表达变化对大隐静脉平滑肌细胞(human saphenous vein smooth musclecells，HSVSMCs)的增生和迁移影响，为下一步应用研究做铺垫。
　　方法：1.收集CABG术后剩余大隐静脉片段，HSVECs的分离培养采用胶原酶消化法，并应用VWF免疫荧光染色进行鉴定。HSVSMCs的分离培养采用组织块法，并应用α-SMA细免疫荧光染色进行鉴定。
　　2.我们分别采用了EdU实验、划痕实验、transwell实验评价miR-126-3p对HSVECs增殖和迁移能力的影响。RT-PCR和westernblot检测miR-126-3p的潜在靶基因SPRED-1和PIK3R2的mRNA和蛋白表达变化。同时采用western blot方法检测VEGF相关通路p-ERK、ERK、p-AKT、AKT蛋白的表达变化。
　　结果：1.成功分离并鉴定了原代HSVECs和HSVSMCs。内皮细胞预转染实验证实，100nmol miR-126-3p agomir可达到最佳转染效率。EdU实验证实，上调或下调miR-126-3p表达能够增强或抑制HSVECs增殖。同时，划痕实验和transwell实验证实上调或下调mi-126-3p表达可以增强或抑制HSVECs迁移。
　　2.PT-PCR实验证实上调或下调miR-126-3p表达可使miR-126-3p的潜在靶基因SPRED-1和PIK3R2mRNA表达降低或者升高，western blot实验进一步证实上调或下调miR-126-3p表达可使SPRED-1和PIK3R蛋白表达量降低或者升高。同时western blot实验证实上调或下调miR-126-3p表达，可分别使PI3K/AKT信号通路和MAPK/ERK1/2信号通路磷酸化程度增强或者抑制。
　　结论：1.miR-126-3p通过下调其靶基因SPRED-1和PIK3R2的表达，经ERK和AKT信号通路促进HSVECs增殖和迁移。
　　2.miR-126-3p对HSVSMCs增殖和迁移功能没有影响。
　　第三部分 过表达miR-126-3p对离体培养的大隐静脉血管内膜增生和再内皮化的离体研究
　　目的：探讨过表达miR-126-3p对离体培养的大隐静脉内膜增生和再内皮化的影响，为miR-126-3p参与移植血管保护提供进一步实验支持，并为下一步miR-126-3pagomir体内应用提供理论依据。
　　方法：收集CABG患者术后残余大隐静脉片段，建立大隐静脉离体培养模型。分为四组:未培养组、对照组（离体培养14天）、NC agomir组(离体培养14天+miR-126-3p negtive control agomir)、miR-126-3p agomir组(离体培养14天+miR-126-3p agomir)。收集不同组标本，行HE染色评估大隐静脉血管内膜增生状况;行血管内皮层CD31免疫组化染色，评价大隐静脉血管再内皮化情况。
　　结果：1.给予离体培养的大隐静脉miR-126-3p agomir能够减轻大隐静脉血管内膜增生;
　　2.给予离体培养的大隐静脉miR-126-3p agomir促进大隐静脉血管再内皮化。
　　结论：通过miR-126-3p agomir过表达miR-126-3p能够促进离体大隐静脉内皮化，减轻血管内膜增生，这为miR-126-3p下一步的活体应用研究提供了实验依据。
　　第四部分 过表达miR-126-3p对移植静脉桥血管再内皮化和内膜增生的体内研究
　　目的：探讨局部应用miR-126-3p agomir对大鼠移植桥血管再内皮化和内膜增生的影响。
　　方法：构建自体静脉移植大鼠动物模型，局部转染Cy3标记的miR-126-3p agomir，荧光成像和western blot评价转染效率。实验组分成四组，正常对照组，血管移植组，NC agomir组、miR-126-3p agomir组。血管移植术后28天，行血管彩超评价移植静脉内径和血流动力学改变。HE染色评价内膜增生，Masson染色评价胶原蛋白沉积，PCNA免疫组化、α-SMA免疫组化染色评价VSMC增生情况。Evans染色、CD31免疫荧光评价移植血管再内皮情况，CD68免疫组化评价炎症细胞侵润情况。
　　结果：1.成功构建大鼠静脉移植模型，免疫荧光和western blot实验证实局部转染miR-126-3p agomir效果好。
　　2.大鼠血管彩超检查提示:局部转染miR-126-3p agomir能够减轻大鼠静脉移植血管狭窄，改善移植血管血流动力学。
　　3.HE评价内膜增生染色证实局部给予miR-126-3p agomir与血管移植组，NC agomir组相比明显降低内膜增厚。Masson染色结果提示局部给予miR-126-3pagomir对胶原蛋白沉积无影响。PCNA免疫组化和α-SMA免疫组化结果表明局部给予miR-126-3p agomir可明显改善移植血管内膜平滑肌增生和迁移程度。
　　4.Evans染色、CD31免疫荧光结果表明局部给予miR-126-3p agomir可促进移植血管再内皮化，CD68免疫组化表明，局部给予miR-126-3p agomir可减轻炎症细胞浸润。
　　结论：1.局部过表达miR-126-3p能够降低移植血管狭窄，改善血流动力学，其主要机制是miR-126-3p能够促进移植血管再内皮化，减轻炎症反应，从而抑制内皮下VSMC过度增生和异常迁移，减轻移植血管内膜增生。
　　2.miR-126-3p agomir局部转染的方法为移植血管再狭窄的防治提供了新思路。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

前言

第一部分 循环miR-126-3p在CABG患者手术前后表达变化的临床研究

引言

材料与方法

结果

小结

第二部分 miR-126-3p对大隐静脉内皮细胞及平滑肌细胞的影响和作用机制的体外研究

引言

材料与方法

结果

小结

第三部分 过表达miR-126-3p对离体培养的大隐静脉内膜增生和再内皮化的离体研究

引言

材料与方法

结果

小结

第四部分 过表达miR-126-3p对移植静脉桥血管再内皮化和内膜增生的体内研究

引言

材料与方法

结果

小结

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

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