原发性肝癌合并门静脉癌栓的原代细胞培养及其生物学特性的研究

摘要

研究背景： 原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，原发性肝细胞癌的发病率和病死率分列第五和第三位。在我国，通过病理切片分析和影像学检查约30％到60％的晚期肝癌患者被发现门静脉主要分支内有癌栓的存在，镜下检查中发现率更高，同时门静脉癌栓的研究也越来越受到重视，原因是肝癌的预后与是否伴有门静脉癌栓及其分型分期密切相关，如若不经治疗，原发性肝癌合并门静脉癌栓患者生存时间通常为约为3到4个月，而不合并门静脉癌栓的肝癌患者生存时间约为1年左右。所以门静脉癌栓的相关研究已经成为我国肝癌研究的一个重大分支课题。但是，绝大多数现有的治疗仍然只是对症治疗，对合并门静脉癌栓的原发性肝癌也只是主要对原发灶和门静脉癌栓的切除，并没有针对主要影响复发和转移的因素进行有效的靶向治疗或针对性的预防。所以找到影响合并门静脉癌栓的原发性肝癌预后极差的原因尤为重要和迫切。循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是1869年Ashworth在一例肿瘤死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤细胞的异性细胞，并且首次提出了循环肿瘤细胞的概念。早期循环肿瘤细胞的研究常见于白血病方面的探索，现在随着检测技术的进步，循环肿瘤细胞越来越多见于肺癌，乳腺癌，肝癌的研究领域。传统观点认为肿瘤的转移往往在肿瘤发展的后期，可是现在的观点强调在肿瘤发展的早期就可能有循环肿瘤细胞的出现并提示与预后的相关性，这为合并门静脉癌栓的原发性肝癌的诊断提供了可能性。人类簇分化抗原44(Clusterofdifferentiation44，CD44)它的基因在11号染色体的短臂。人们对CD44的研究时间比较长也比较深入，目前已知它是一种分布极为广泛的细胞表面跨膜的糖蛋白，主要参与肿瘤细胞与宿主细胞的粘附过程，而这个过程在肿瘤的侵袭和转移中起到关键作用，CD44与肿瘤侵润转移的关系的研究现已有大量的报道，CD44S在人类各种恶性肿瘤中普遍存在表达，另一亚型CD44V在恶性肿瘤中表达不完全一致，但阳性表达者较易发生脉管浸润和远处转移，同时阳性者无瘤生存期短，预后差。细胞表面粘附分子CD133，又称AC133，也被称为prominin-1，是一种特别的跨膜糖蛋白，随着细胞的不断分化和成熟，CD133的表达也同时迅速下调，于是人们把它作为一个分离和鉴定干细胞的独特表面标志物。起初CD133被认为是造血干细胞、内皮祖细胞等的标志物之一，但后来在脑肿瘤、肺癌和前列腺癌中也出现CD133的表达，但是在对肿瘤干细胞研究的不断深入中也发现了把CD133作为干细胞的筛选标志存在一定的局限性，比如在2008年，Wang等发现CD133-的胶质瘤细胞同样具有致瘤性，而且CD133-胶质瘤细胞能分化成CD133+细胞，由此推断的确存在一部分CD133胶质瘤细胞胞具有成瘤能力。 研究目的： 分析20例采集于伴门静脉癌栓原发性肝癌的原代细胞，观察癌栓和原发灶两种原代细胞的生长情况;通过对同一伴门静脉癌栓原发性肝癌患者的原发灶及癌栓两种原代细胞中干性表面标志物的表达和成瘤能力的差异研究，探讨影响伴门静脉癌栓肝癌的预后因素到底是癌栓本身还是原发灶，同时讨论癌栓的来源和治疗重心;通过回顾性的研究伴门静脉癌栓肝癌患者组和不伴癌栓组外周血中循环肿瘤细胞去唾液酸糖蛋白受体的表达情况，验证去唾液酸糖蛋白受体做为伴门静脉癌栓和不伴门静脉癌栓肝癌早期诊断性标志小分子的特异性及敏感性，探讨使用去唾液酸糖蛋白受体做为肝癌是否会发生门静脉癌栓的早期诊断分子的可行性。 研究方法： 第一部分:原发性肝癌合并门静脉癌栓的原代细胞培养 经过对20例原发性肝癌患者的标本处理，目前能稳定生长的有5位患者的肝癌原发灶和癌栓原代细胞以及一位患者的外周血和门脉血中分离的原代细胞。显微镜下可见体外培养的细胞大多呈梭角形及不规则多边形，体积大小不等，细胞形态呈上皮样排列生长并有岛屿状重叠堆积生长的能力，原发灶原代细胞密度大于癌栓原代细胞。 第二部分:分析肝癌门静脉癌栓和原发灶的原代细胞中CD44和CD133的表达差异及对成瘤能力的影响 通过对同一伴门静脉癌栓原发性肝癌患者的原发灶及癌栓两种原代细胞中干性表面标志物的表达和成瘤能力的差异研究，探讨影响伴门静脉癌栓肝癌的预后因素到底是癌栓本身还是原发灶，同时讨论癌栓的来源和治疗重心。 第三部分:原发性肝癌循环肿瘤细胞的分选及去唾液酸糖蛋白受体的表达分析 通过回顾性的研究36例伴门静脉癌栓肝癌患者组和不伴癌栓组外周血中循环肿瘤细胞去唾液酸糖蛋白受体的表达情况，验证去唾液酸糖蛋白受体做为伴门静脉癌栓和不伴门静脉癌栓肝癌早期诊断性标志小分子的特异性及敏感性，探讨使用去唾液酸糖蛋白受体做为肝癌是否会发生门静脉癌栓的早期诊断分子的可行性。 研究结果： 第一部分:经过对20例原发性肝癌患者的标本处理，目前能稳定生长的有五位患者的肝癌原发灶和癌栓原代细胞以及一位患者的外周血和门脉血中分离的原代细胞。显微镜下可见体外培养的细胞大多呈梭形或不规则的多边形，体积大小不等，细胞形态呈上皮样生长并有岛屿状重叠堆积生长的能力，原发灶原代细胞密度大于癌栓原代细胞，生长曲线也有上述趋势。 第二部分:通过在五对肝癌原发灶和癌栓的研究中发现，CD44分子的表达有统计学差异(*P＜0.05)，CD133分子的表达无统计学差异(P＞0.05)，而成瘤能力表现为原发灶组大于癌栓组。(*P＜0.05) 第三部分:通过对36例全血样本中循环肿瘤细胞的去唾液酸糖蛋白受体的表达的回顾性验证情况，流式细胞仪的结果显示去唾液酸糖蛋白受体在两对样本中的表达有显著差异(***P＜0.05)，并切其特异性和敏感性较好，有可能作为原发性肝癌是否会发生癌栓的一个早期诊断指标，该分子有可以应用于临床的潜在可能。 结论： 1、原发性肝癌合并门静脉癌栓的原代细胞中原发灶原代细胞密度大于癌栓原代细胞，生长曲线也有上述趋势。 2、通过在五对肝癌原发灶和癌栓的研究中发现，CD44分子的表达有统计学差异(*P＜0.05)，CD133分子的表达无统计学差异(P＞0.05)，而成瘤能力表现为原发灶组大于癌栓组。(*P＜0.05) 3、通过对36例全血样本中循环肿瘤细胞的去唾液酸糖蛋白受体的表达的回顾性验证情况，流式细胞仪的结果显示去唾液酸糖蛋白受体在两对样本中的表达有显著差异(***P＜0.05)。 本课题创新点及潜在应用价值： 发现伴门静脉癌栓的肝癌原发灶原代细胞比癌栓原代细胞生长较快;进一步首次发现并提出同一伴门静脉癌栓肝癌患者的原发灶和癌栓原代细胞中，CD44分子的表达是有显著差异的，而且两者在生物学功能上也是有明显区别的;研究了外周血循环肿瘤细胞中伴门静脉癌栓和不伴门静脉癌栓两组肝癌患者的去唾液酸糖蛋白受体分子的表达出现了显著差异。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分 原发性肝癌合并门静脉癌栓的原代细胞培养材料

一、材料

二、方法

三、结果

三、讨论

参考文献

第二部分 分析肝癌门静脉癌栓和原发灶的原代细胞中CD44和CD133的表达差异及对成瘤能力的影响

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

参考文献

第三部分 原发性肝癌循环肿瘤细胞的分选及去唾液酸糖蛋白受体的表达分析

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

参考文献

结论

综述 展望原发性肝癌及门静脉栓的诊断和治疗

致谢