氦气预适应对减压病及肝脏/大脑缺血再灌注损伤的保护作用和机制研究

摘要

减压病(decompressionsickness，DCS)是由于当机体所处的环境周围压力变化速度过快或变化幅度过大所导致的一系列心肺功能衰竭和神经系统损伤。神经系统损伤主要是脊髓损伤，其症状包括:感觉异常、行走困难、瘫痪甚至死亡。脊髓损伤，尤其是脊髓白质的损伤被认为是DCS最主要的损伤靶器官。虽然神经型DCS没有明显的病因学，但是血管和组织中的气泡被公认为是导致DCS的元凶。气泡通过以下两个途径造成脊髓损伤:第一，血管内或血管外的气泡可以直接对血管进行机械压迫，从而减少脊髓血管的灌流;第二，气泡可能引起一系列生化反应，例如:中性粒细胞的粘附、血小板的活化以及补体的激活，这些继发性反应会进一步加重缺血损伤。虽然缺血在减压所致的脊髓损伤中扮演的角色仍然存在着争议，但是近期的研究报道脊髓缺血是导致许多神经系统症状的原因。在动物模型上也证实了以抗缺血为治疗靶点的作用方式能够缓解DCS的发生。 减压后呼吸氦气已被证实是缓解神经型DCS症状的良好的治疗方法。在动物模型上，减压后的大鼠呼吸一定时间的氦气能够缓解脊髓诱发电位的损伤。氦气对DCS的保护作用之前一直被认为是其物理性质决定的。然而，近期的研究显示，氦气的生物化学性质也可能参与对DCS的保护机制中。另一方面，氦气预适应(heliumpreconditioning，HPC)也能够对心脏和大脑的缺血再灌注(ischemiareperfusion，IR)损伤起到保护作用，提示HPC也可能对DCS具有一定的作用。许多信号通路可能参与HPC的保护机制中，但是HPC的具体机制及其影响通路仍然需要深入研究。 IR是器官移植、器官储藏和肿瘤中常发生的病理生理过程。其损伤包括细胞的直接缺血死亡和继发性炎症激活所致的延迟损伤。IR的病理变化包括:细胞的肿胀、内皮细胞的损伤、中性粒细胞的粘附、细胞的坏死和凋亡。即使手术方式和储藏技术的日新月异，器官组织在移植手术过程中仍不可避免的发生IR损伤，从而导致器官功能失活、免疫排斥反应和器官移植手术的失败。因此，对于如何预防器官移植手术发生IR仍然迫切需要寻找一种有效的防治措施。 氦气具有良好的理化特性和无血流动力学影响，因此呼吸氦气在临床上和潜水医学领域是一种安全的方式。近期的研究显示氦气有明显的抗缺血功能，大脑和心脏可以明显的被HPC（呼吸氦气5分钟，间隔呼吸空气5分钟三次）保护。然而，HPC的机制和其所致的信号通路仍不明确。phosphatidylinositol-3-kinase(PI3k)/Akt通路是一种可以由许多应激源激活的“存活信号通路”，可以保护细胞免受损伤。被激活的Akt可以调节下游一系列的分子，包括glycogensynthasekinase-3β(GSK-3β)和Bcl-2-associateddeathpromoter(BAD)。Akt的激活可以通过GSK-3β和BAD从而抑制caspase3的活性、减少细胞的凋亡。另外，Akt也可以抑制NF-κB，从而抑制炎症细胞的粘附。Akt的激活还能够抑制c-JunN-terminalkinase(JNK)并减少细胞的坏死。PI3k也是p38mitogen-activatedproteinkinase(p38MAPK)的上游激活剂，从而调节细胞的坏死。因此，PI3k/Akt的激活或许是保护IR重要的信号通路。根据以上论述，我们推测HPC对IR的保护作用可能与PI3k/Akt的激活有关。 第一部分:氦气预适应对大鼠减压所致的神经损伤的保护作用研究 方法: 50只雄性的SD大鼠分为两组:1、DCS组(n=25)和2、DCS+HPC组(n=25)。大鼠以101kPa每分钟的速度加压至709kPa高气压暴露60分钟。接着，动物以203kPa每分钟的速度减压至常压。HPC组的动物在减压模型前需暴露5分钟氦气(7∶3氦氧混合气)间隔5分钟空气三次。另外5只动物作为病理检测的阴性对照。我们采用临床症状观察、神经功能评分、血小板计数、病理检测、多普勒气泡探测的方法作为评价指标。 结果: HPC能够显著降低DCS的发病率，延长发病时间。HPC同时能够显著缓解减压后15分钟神经功能的评分。减压后DCS组和DCS+HPC组的血小板计数较减压前均显著降低，但是两者之间降低比值却无统计学差别。HPC不能缓解减压后多普勒气泡的等级。减压后损伤严重的大鼠脊髓病理可见明显的脱髓鞘变化。 结论: 氦气预适应能够减少DCS的发病率并缓解减压后所致的神经系统损伤。 第二部分:氦气预适应通过PI3k/Akt途径保护小鼠肝脏缺血再灌注损伤方法: 我们采用BALb/c小鼠的70％肝脏缺血再灌注模型，选用血清Alt、肝脏病理、RT-PCR、Westernblot作为检测指标。暴露氦气预适应HPC的小鼠在缺血前给予7∶3的氦氧混合气5分钟间隔空气5分钟三次。我们同时探讨了PI3k/Akt的激活启动分子以及HPC对肝脏IR保护作用的主要成分（呼吸氦气、空气间隔还是两者联合作用）。 结果: 我们发现HPC可能保护肝脏IR的损伤，这种保护作用可以被PI3k抑制剂阻断。HPC可以诱导Akt磷酸化的提前激活，并且Akt的激活参与HPC对肝细胞坏死和存活率的保护机制中。HPC同时还能够诱导Akt下游的相关分子从而抑制肝细胞的凋亡并减少炎症细胞的粘附。HPC激活PI3k/Akt通路的机制可以被A2a腺苷受体抑制剂阻断，同时能够被PTEN抑制剂所恢复。我们证实了HPC对肝脏IR的保护作用以及激活PI3k/Akt的有效成分是呼吸氦气和空气间隔的联合作用。 结论: 1、HPC可以缓解小鼠肝脏IR的损伤;2、HPC对肝脏IR的保护作用是通过提前激活PI3k-Akt通路，Akt的激活上游调控分子可能是A2a腺苷受体;3、HPC对肝脏IR的保护作用的有效成分是呼吸氦气和空气间隔的联合作用，而不是两者单独的影响因素本身。 第三部分:氦气预适应对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用 方法: 观察氦气预适应(HPC)对大鼠急性脑缺血/再灌注(IR)损伤的作用，并初步探讨其可能机制。采用线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血(2h)/再灌注(24h)模型，并将SD大鼠随机分为3组:假手术组、模型组和HPC组。检测指标包括神经功能学评分、脑梗死面积、脑组织尼氏染色、超氧化物歧化酶活性(SOD)及丙二醛(MDA)含量。 结果: 与模型组相比，HPC能显著改善脑缺血后大鼠神经功能，降低大鼠急性IR后脑梗死面积、脑组织MDA含量，增加SOD活性。 结论: HPC对大鼠局灶性急性IR损伤有一定的保护作用，氧自由基的清除在其保护机制中可能扮演着重要的作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分：氦气预适应对大鼠减压病的保护效应

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第二部分：氦气预适应通过PI3k-Akt通路对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第三部分：氦气预适应对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

结论

综述1：氦气在治疗脊髓型减压病和缺血再灌注损伤中的应用前景

综述2：氦气预适应通过PI3k-Akt通路对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用前景探讨

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