miR-199a-5p调控内质网应激对毒性胆汁酸导致肝损伤的保护作用及机制研究

摘要

目的：
　　胆汁淤积是常见的肝胆疾病，许多疾病都会引起肝内胆汁淤积，如恶性肿瘤、胆管狭窄、免疫疾病或毛细胆管炎等。胆汁淤积本身可以导致肝脏急性损伤、全身炎性反应、多器官功能障碍。胆汁淤积引起肝损伤的发病机制尚未完全清楚，可能包括氧化应激反应以及毒性胆汁酸淤积所导致的肝损伤，毒性胆汁酸的蓄积对肝细胞本身引起的损伤越来越得到重视，其机制就包括了内质网应激。
　　肝细胞在许多不良刺激情况下会引起内质网内的未折叠蛋白/错误折叠蛋白的积蓄，从而发生内质网应激（ER stress），ER stress是细胞自我保护的一种反应，但是过强/持续性的ER stress会导致细胞一系列病理改变甚至引起细胞的死亡。
　　肝细胞承担了很重的蛋白合成任务，ER保持了高效的蛋白折叠以处理新合成的蛋白。然而ER的稳态可以为蛋白后修饰错误、蛋白错误折叠和病毒蛋白所打破，所有的这些都能激活未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR）通路。最新的研究证明UPR在多种肝脏疾病中起到了重要的作用，例如胰岛素抵抗，肝脂肪变性，酒精性肝损伤，胆汁淤积性肝病。
　　内质网应激主要激活了IRE1α、PERK、ATF6三个未折叠蛋白反应感受元件及其各自下游通路，如果内质网应激持续存在，其下游的级联反应主要通过CHOP、caspase-12、JNK通路导致了细胞的凋亡，促进炎症反应，导致疾病的发生和发展。
　　在内质网应激的过程中，机体是如何调整适度应激和过度应激之间平衡的？又是什么机制在影响内质网应激的进程？这些问题是临床及研究工作中所亟需回答的问题。
　　microRNA是一族非编码的RNA，可以调节基因的转录后的表达。它们可以特异的与mRNAs的3‘非编码区域（3‘UTR）结合，引起mRNA的降解，抑制转录。近期的研究发现microRNA介导的转录后调控网络对多种肝脏疾病均有重要意义。
　　miRNAs在肝细胞内质网应激中的作用和机制还不明确。有研究证明在人和老鼠肝细胞中，miR-199a的表达水平变化可以改变肝病、肝癌的进程。近来，miR-199a已被证明在肿瘤中可以靶向GRP78以调节内质网应激。但miR-199a在肝内质网应激中具体的调节机制还不明确，有待进一步研究。本研究拟针对在胆汁酸引起肝细胞内质网应激的过程中，microRNA起到的调节作用开展工作，以进一步揭示内质网应激的分子调节机制。
　　方法：
　　1.通过胆总管双重结扎建立梗阻性黄疸小鼠模型，每天观测小鼠生存情况及体重变化，10天后收集血浆及肝脏标本。
　　2.毒胡萝卜素（tunicamycin，TG）作为特异的诱导细胞内质网应激的刺激因素；脱氧胆酸（DCA）作为模拟胆汁淤积时毒性胆汁酸的作用；DMSO作为阴性对照处理剂。
　　3.shRNA抑制Dicer酶，观察microRNA是否参与了内质网应激调控。
　　4.构建携带靶基因或干扰的慢病毒，作为外源性导入特定基因的载体。
　　5.运用流式细胞仪观察细胞的凋亡情况。
　　6.使用Targetscan、Transfac数据库对靶基因相互作用的miR以及启动子区域进行生物信息学分析预测。
　　7.qRT-PCR检测样本中miR各转录本水平。
　　8.Western Blot检测样本中蛋白分子水平。
　　9.双荧光素酶报告基因实验检测miRNA与靶基因mRNA3‘UTR的作用。
　　10.LDH释放法评价细胞凋亡情况。
　　11.运用自动生化分析仪检测肝功能。
　　12.ChIP法检测转录因子与靶基因的结合情况。
　　13.HE染色、免疫组化观察肝脏形态学改变及炎症细胞浸润。
　　结果：
　　（一）抑制Dicer基因后，胆汁酸引起内质网应激的持续存在，从而引起肝细胞凋亡，说明miRNA在调节内质网应激缓解的过程中起重要的作用。
　　（二）miRNA-199a-5p可以调节内质网应激
　　1.生物信息法分析显示miR-199a-5p可以调控内质网应激中关键分子GRP78、ATF6、IRE1α。
　　2.胆汁酸刺激可以引起内质网应激，同时miR-199a-5p水平也明显上调。
　　3.在鼠肝细胞胆汁酸刺激、鼠胆总管结扎模型中miR-199a-5p升高。
　　4.外源性、内源性miR-199a-5p直接作用于GRP78、ATF6、IRE1α的3‘UTR（三）miR-199a-5p可以调节内质网应激减少胆汁酸刺激引起的肝细胞凋亡。
　　1.抑制miR-199a-5p表达将导致持续性内质网应激。
　　2.抑制miR-199a-5p的表达促进肝细胞在DCA、TG处理后的凋亡。
　　3.miR-199a-5p通过对IRE1α的抑制保护肝细胞。
　　（四）AP-1调控miR-199a-5p的转录
　　1.在TG、DCA处理后的肝细胞中，miR-199a-5p的初级转录体（pri-）和前体（pre-）都明显上调。
　　2.生物信息学分析发现AP-1可能调控了MIR199A2。
　　3.DCA、TG处理后肝细胞中AP-1明显升高
　　4.ChIP实验发现AP-1可以与MIR199A2的启动子区域结合。
　　5.JNK通路的抑制剂SP600125抑制了AP-1的激活，同时也抑制了miR-199a-5p转录导致持续内质网应激。
　　6.SP600125抑制AP-1后，外源性补充miR-199a-5p可以同样起到缓解内质网应激、保护肝细胞的作用。
　　结论：
　　本课题以DCA刺激模拟毒性胆汁酸造成的肝细胞损伤，以胆总管结扎的小鼠作为动物模型，研究毒性胆汁酸导致内质网应激引起肝细胞损伤的机制和内质网应激中miR-199a-5p的保护作用和调节机制。
　　得到以下结论：
　　一、miR-199a-5p参与了毒性胆汁酸引起肝细胞内质网应激的调控。
　　二、miR-199a-5p可以靶向内质网应激中的关键分子GRP78、ATF6、IRE1α的3‘UTR。
　　三、miR-199a-5p可以缓解内质网应激，在毒性胆汁酸刺激中保护肝细胞，且其保护作用主要是依赖对IRE1α通路的抑制发挥的。
　　四、JNK通路激活的AP-1作为转录因子与MIR199A2启动子区域结合上调miR-199a-5p的表达水平。
　　五、在AP-1被抑制的情况，补充miR-199a-5p也能发挥内质网应激调节作用保护肝细胞。
　　本研究发现毒性胆汁酸蓄积可以导致细胞的凋亡，其导致凋亡的机制与内质网应激密切相关；而miR-199a-5p作为内质网应激关键分子GRP78、ATF6、IRE1α的调节因素，可以缓解过度的内质网应激，从而发挥其对肝细胞的保护作用；AP-1作为JNK通路激活的转录因子，又可以反馈性的升高miR-199a-5p。说明机体的内质网应激是一个负反馈调节机制，而miR-199a-5p在这个负反馈调节机制中起到非要重要和关键的作用。

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英文缩略词表

第一部分miR-199a-5p参与调节内质网应激

前言

材料与方法

结果

第二部分miR-199a-5p通过抑制IRE1α保护肝细胞

前言

材料与方法

结果

第三部分内质网应激中miR-199a-5p上调的机制

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述一:内质网应激与肝脏疾病

文献综述二:microRNA与肝脏疾病

成果和发表论文

致谢