BLT1拮抗剂对脓毒症小鼠的保护作用及其可能机制

摘要

目的：
　　脓毒症（sepsis）是指一种机体的炎症与免疫亢进状态，通常由创伤、感染等因素引起，严重损害机体的正常生理功能，预后极差且死亡率很高。免疫系统的功能紊乱是其病理生理过程中的重要特点，后期通常会出现顽固的免疫抑制，淋巴细胞的凋亡及其功能障碍在免疫抑制中扮演重要的角色，从而更加加重免疫功能紊乱，但是其倒底如何促进免疫抑制和造成免疫系统功能紊乱目前尚不明了。
　　白三烯B4(leukotriene B4,LTB4)是由花生四烯酸代谢产生的一类脂类介质，作为一种强有力的炎性介质和趋化因子，通过与其相应受体结合在许多疾病中都发挥着重要作用。白三烯B4受体1(leukotriene B4 receptor1,BLT1)是LTB4的高亲和力受体，主要在白细胞尤其在中性粒细胞、单核-巨噬细胞和嗜酸性粒细胞上表达。目前已有研究表明LTB4通过BLT1参与支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、接触性皮炎及多发性硬化等病理生理过程。U-75302是BLT1的特异性拮抗剂，可以阻断LTB4/BLT1通路。
　　以往LTB4总是作为炎症介质被研究，近年其通过BLT1介导的免疫调控作用备受关注。目前国外已有研究表明LTB4/BLT1通路参与天然免疫和获得性免疫系统免疫细胞功能的调控。在与免疫功能密切相关的脓毒症中LTB4/BLT1通路是否也能发挥免疫调控作用？以及干预LTB4/BLT1通路能否影响脓毒症的预后和免疫系统功能尚未见报道。本实验主要研究利用特异性的BLT1拮抗剂U75302阻断LTB4/BLT1通路后，是否能改善脓毒症小鼠的预后，是否能减少淋巴细胞的凋亡，从而探寻脓毒症监测和治疗的新靶点。
　　方法：
　　1、脓毒症小鼠模型通过盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）术建立。将12只雄性C57BL/6小鼠按完全随机的原则分为2组，分别是假手术组（Sham,n=6）和CLP组（CLP,n=6），手术24h时利用ELISA术检测Sham组小鼠和CLP组小鼠外周血LTB4水平以及腹腔冲洗液LTB4水平。
　　2、将30只雄性C57BL/6小鼠按完全随机的原则分为3组，分别是假手术组（Sham,n=10）、CLP组（CLP,n=10）和CLP+腹腔注射BLT1拮抗剂U75302组（U75302,n=10），手术后1h时按分组给予生理盐水（每只100μl）或BLT1拮抗剂U75302（每只5μg/100μl），观察不同组别小鼠的生存时间与7d生存率。
　　3、将18只雄性C57BL/6小鼠按完全随机的原则分为3组，分别是假手术组（Sham,n=6）、CLP组（CLP,n=6）和CLP+腹腔注射BLT1拮抗剂U75302组（U75302,n=6），手术后1h时按分组给予生理盐水（每只100μl）或BLT1拮抗剂U75302（每只5μg/100μl）。24h时抽取各组小鼠外周血及腹腔冲洗液，并摘取各组小鼠肝组织、肺组织。通过肝肺组织病理染色检测肝肺损伤情况，同时检测血液及腹腔冲洗液的细菌负荷，用酶联免疫吸附法检测血浆TNF-α、IL-6和IL-10水平。
　　4、将18只雄性C57BL/6小鼠按完全随机的原则分3组，分别是假手术组（Sham,n=6）、CLP组（CLP,n=6）和CLP+腹腔注射BLT1拮抗剂U75302组（U75302,n=6），手术后1h时按分组给予生理盐水（每只100μl）或BLT1拮抗剂U75302（每只5μg/100μl）。24h时采集各组小鼠腹腔冲洗液并摘取各组小鼠脾脏及胸腺，样品处理后用流式细胞术检测小鼠胸腺T淋巴细胞凋亡情况，同时检测各组脾脏CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及CD4+CD25+T淋巴细胞细胞计数，检测小鼠腹腔冲洗液CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、中性粒细胞细胞计数。
　　结果：
　　1、CLP术后24h时，脓毒症小鼠外周血和腹腔冲洗液中LTB4水平较假手术组均显著升高（P<0.05）。
　　2、CLP术后1h时给予腹腔注射BLT1拮抗剂U75302，U75302组小鼠生存时间及7d生存率高于CLP组（P<0.05）。
　　3、CLP术后24h时，与CLP组相比，U75302组小鼠肝、肺组织病理损伤均减轻（P<0.05），且U75302组小鼠血液和腹腔冲洗液细菌菌落数均显著降低（P<0.01），另外促炎细胞因子TNF-α、IL-6水平在U75302组均显著降低(P<0.01)，而抗炎细胞因子IL-10水平在各组间无明显统计学差异。
　　4、CLP术后24h时，与CLP组相比，U75302组小鼠胸腺CD3+细胞凋亡比例显著降低（P<0.01），U75302组小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞以及CD4+CD25+T淋巴细胞细胞计数均降低（P<0.05），U75302组小鼠腹腔冲洗液CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞细胞计数均升高（P<0.05），中性粒细胞细胞计数降低（P<0.01）。
　　结论：
　　外周血和腹腔冲洗液中的LTB4水平在CLP组明显升高。使用BLT1特异性拮抗剂U75302之后，可以提高CLP小鼠的生存时间和7d生存率，减轻肝、肺组织病理损伤，提高血液和腹腔冲洗液细菌清除率，降低血浆促炎细胞因子TNF-α、IL-6水平，同时减少CLP小鼠胸腺T淋巴细胞的凋亡，对其具有明显的保护作用。

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英文缩略词对照表

前言

第一部分 脓毒症小鼠外周血和腹腔冲洗液中LTB4的水平

材料与方法

结果

讨论

第二部分 U75302对脓毒症小鼠的保护作用

材料与方法

结果

讨论

第三部分 U75302对脓毒症小鼠免疫功能的影响

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

文献综述:白三烯B4受体1对免疫功能的调控作用及其机制研究进展

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