异丙酚遗忘作用的环腺苷酸机制及组胺H3受体的干预作用

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 海马区cAMP信号在异丙酚引起的遗忘中的作用 目的： 异丙酚具有起效快，作用时间短等特点，是临床上最常用的静脉麻醉药，被广泛应用于全身麻醉或者局部麻醉以及检查中的镇静。异丙酚除了有镇静催眠和麻醉的作用，还具有影响记忆形成导致遗忘的作用。目前异丙酚遗忘作用的机制仍然不十分清楚。长时程增强（long-term potentiation,LTP）被普遍认为是学习记忆的细胞分子机制。动物模型上的研究表明异丙酚可抑制海马CA1区LTP，但是具体的作用途径并不清楚。环腺苷酸（Cyclic adenosine monophosphate,cAMP）信号通路是突触可塑性以及记忆形成中的重要信号通路之一。研究表明异丙酚可抑制海马中cAMP信号通路下游环腺苷酸反应元件结合蛋白的活化从而影响神经营养因子等蛋白的表达，但是异丙酚如何影响cAMP信号通路以及cAMP信号通路在异丙酚抑制LTP以及记忆形成中的作用，仍需进一步研究。因此，本研究在大鼠海马脑片上，通过分子生物学、脑片电生理、动物行为学等方法研究异丙酚影响cAMP信号通路的作用途径，并研究cAMP信号通路在异丙酚抑制LTP以及记忆形成中的作用。 方法： （1）放射免疫法检测海马组织中cAMP浓度。为了观察异丙酚对cAMP浓度的影响以及可能的作用途径，共设置三种脑片孵育方案：正常人工脑脊液孵育、腺苷酸环化酶激活剂FSK以及同时孵育FSK和磷酸二酯酶拮抗剂IBMX。每组脑片上的实验均设溶媒对照组（0.1%DMSO）及异丙酚组。孵育后分离海马组织进行匀浆取上清，放射免疫法测海马组织中cAMP浓度。（2）分子生物学方法检测磷酸二酯酶4（Phosphodiesterase4,PDE4）的活性及蛋白表达的影响。应用酶联免疫反应和免疫印迹技术检测大鼠脂肪乳剂腹腔注射（对照组）和异丙酚腹腔注射（异丙酚组）30分钟和120分钟后海马组织中PDE4的活性和蛋白表达。（3）离体脑片电生理记录海马CA1区LTP。在大鼠海马脑片上记录CA1区兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potentials,fEPSP），应用FSK化学刺激、theta频电刺激（theta burst stimulation，TBS）或高频电刺激（high frequency stimulation,HFS）分别诱导LTP。分别灌流异丙酚（50μM）或PDE4选择性拮抗剂rolipram（0.1μM）观察LTP的变化。（4）行为学方法研究大鼠恐惧学习记忆。成年雄性SD大鼠随机分均为4组，分别为生理盐水对照组、异丙酚（25mg/kg，训练前30min腹腔注射）处理组、rolipram（1mg/kg，训练前30min腹腔注射）处理组和异丙酚＋rolipram处理组。各组别大鼠均接受相同的场景恐惧和声音恐惧记忆训练。24h后各组大鼠接受记忆能力测试，包括场景、非场景恐惧记忆以及声音恐惧记忆测试。 结果： （1）在正常人工脑脊液孵育和FSK孵育大鼠海马脑片上，异丙酚处理组海马组织中cAMP的浓度显著低于对照组，而同时孵育FSK＋IBMX脑片上，异丙酚与对照组cAMP的浓度无明显差别。表明异丙酚通过影响PDE降低cAMP的浓度。（2）与对照组相比，异丙酚组大鼠海马脑组织中PDE4的活性在30分钟和120分钟均显著升高；PDE4A5的蛋白表达在120分钟较对照组显著上调，30分钟时无明显变化。表明异丙酚可能通过上调PDE4的活性和表达降低海马组织中cAMP浓度。（3）异丙酚（50μM）灌流30分钟可显著抑制TBS或FSK对大鼠海马CA1区LTP的诱导；对HFS诱导的LTP无明显作用。与异丙酚组相比，Rolipram＋异丙酚组中TBS诱导的LTP与对照组无明显差异，而显著高于异丙酚组。此结果表明抑制PDE4的作用可逆转异丙酚对大鼠海马CA1区cAMP信号依赖的LTP的抑制作用。（4）对照组、异丙酚组、rolipram组以及异丙酚＋rolipram组大鼠在恐惧学习训练中僵立时间比例无明显差异。然而，与对照组相比，异丙酚组大鼠在场景恐惧和声音恐惧记忆中的僵立时间比例显著降低，而异丙酚＋rolipram组大鼠在场景恐惧和声音恐惧记忆中的僵立时间比例显著高于异丙酚组，与对照组无明显差异。表明抑制PDE4的作用可逆转异丙酚对海马依赖的和海马非依赖的记忆的抑制作用。 结论： 异丙酚通过上调PDE4的活性及蛋白表达，降低大鼠海马脑片中cAMP浓度，抑制LTP和记忆的形成。PDE4选择性抑制剂rolipram可逆转异丙酚对大鼠海马CA1区cAMP信号依赖的LTP及对海马依赖的和海马非依赖的恐惧记忆的抑制作用。本研究结果不仅发现了cAMP信号通路在异丙酚遗忘中发挥重要作用，揭示异丙酚的作用途径——PDE4，同时也为消除异丙酚遗忘作用提供了潜在的干预途径。 第二部分 激活组胺H3受体对异丙酚引起的短期记忆损害的影响及机制 目的： 异丙酚作为短效的静脉全身麻醉药，其停药后数分钟患者即可苏醒，但是学习记忆等相关的认知功能在异丙酚停药后数小时仍然受到抑制。异丙酚停药后的这种短时认知损害对快通道的检查或短小手术患者具有一定的隐患，这些认知功能的快速恢复对增强患者术后安全，减少患者医院内停留时间，减轻医护人员及患者家属的护理工作具有重要意义。作为组胺H3受体选择性激动剂的α-甲基组胺（(R)-alpha-methylhistamine,RAMH），具有调节递质释放和突触可塑性的作用。研究表明其可增强记忆相关的认知功能以及减轻东莨菪碱引起的记忆损害。因此，本实验观察RAMH是否可以通过影响突触传递和突触可塑性减轻异丙酚的短期记忆损害作用。 方法： 为了观察RAMH对异丙酚引起的记忆损害的影响，成年雄性SD大鼠(10-12周龄)随机分为4组，分别为生理盐水对照组、异丙酚（25mg/kg，训练前30分钟腹腔注射）处理组、RAMH（10mg/kg，训练前60分钟腹腔注射）处理组和异丙酚＋RAMH处理组。所有大鼠均接受相同的水迷宫训练（每天8次隐藏平台训练，连续两天）。第三天移去平台，将所有大鼠从固定点入水进行记忆能力测试。为了观察异丙酚以及RAMH对大鼠海马CA1区突触可塑性的影响，在大鼠（3-4周龄）海马脑片上记录CA1区fEPSP，TBS刺激方案诱导LTP。为了观察异丙酚对兴奋性和抑制性突触传递的影响，全细胞模式下记录海马脑片CA1区锥体神经元细胞自发与微小抑制性、兴奋性突触后电流（Spontaneous/miniatureinhibitory,excitatory postsynaptic currents，sIPSCs/mIPSCs,sEPSCs/mEPSCs）。分析异丙酚灌流前后这些电流的频率和幅度变化。 结果： 水迷宫实验中，与对照组相比，异丙酚组大鼠在目标象限中的时间显著缩短，距目标平台的平均距离显著增加。RAMH处理后显著逆转异丙酚的作用，与对照组无明显差别。表明RAMH可减轻异丙酚引起的遗忘作用。RAMH本身与对照组无明显差异。在大鼠海马CA1区，异丙酚可抑制TBS诱导的LTP。同时灌流RAMH（30μM）可逆转异丙酚对TBS诱导的LTP的抑制作用。RAMH显著降低大鼠海马CA1区锥体神经元sIPSCs和mIPSCs的频率，幅度无明显变化。提示RAMH可通过突触前作用减弱大鼠海马CA1区抑制性突触传递。而RAMH对sEPSCs和mEPSCs的频率和幅度均无明显影响。 结论： 组胺H3受体激动剂可抑制海马CA1区抑制性突触传递，逆转异丙酚对LTP的抑制作用，减轻其引起的短期记忆损害。本研究结果为消除异丙酚给药后残余遗忘效应提供了潜在的药物干预途径。

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