MircoRNA在骨肉瘤发生发展和转移中的作用及其相关机制研究

摘要

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，占原发骨肿瘤17％、恶性原发骨肿瘤的42％。其显著特点是青少年发病率高、恶性程度高、早期定向肺转移率高而预后差。目前骨肉瘤的治疗方法依然是以手术为主、辅助放化疗的综合治疗。虽然因手术方式及手术前、后化疗等综合治疗方法的改进，患者生存期有所提高，但手术后局部肿瘤复发、早期肺转移和肿瘤细胞多重耐药性等因素仍然严重影响着骨肉瘤预后。近年来，虽然针对骨肉瘤的发生发展及转移等领域有着大量的研究，但是对其分子机制，尤其是各过程中骨肉瘤特异性表达分子的鉴定和功能研究尚不全面。因此，从根本上探求骨肉瘤发生及发展分子机制，寻找早期诊断、预后评价的新的分子标记物及骨肉瘤生物治疗新的分子靶点，对改善骨肉瘤的临床诊断和治疗现状有着重要的意义。骨肉瘤术后转移的早期诊断主要依赖于骨肉瘤特异性分子标记的筛选和建立有效便捷的无创性诊断技术，而骨肉瘤转移的治疗主要依赖于骨肉瘤转移相关特异性分子的筛选，目前上述两个方面均还缺乏较有临床价值的发现，近年来兴起的microRNA组学为上述两个领域提供了很有前景的研究策略。 本研究中我们使用骨肉瘤细胞株和临床骨肉瘤样本作为研究对象，用以研究揭示microRNA在骨肉瘤发生、发展及转移过程中的作用。整体实验分为三个部分，第一部分:利用miRNA芯片技术筛选骨肉瘤临床样本中差异表达的microRNA;第二部分:microRNA-143在骨肉瘤发生发展和转移中的作用及其相关机制研究;第三部分:microRNA-148a在骨肉瘤发生发展和转移中的作用及其相关机制研究。 第一部分:利用miRNA芯片技术筛选骨肉瘤临床样本中差异表达的microRNA 目的:利用miRNA芯片技术筛选出对人骨肉瘤组织及癌旁组织之间差异表达的microRNA，并进行数据分析。方法:以两例人骨肉瘤组织为研究对象，癌旁组织为对照，利用Affymetrix公司的miRNA2.0芯片，检测人物种的miRNA表达谱，以表达差异≥2.0倍或≤0.5倍为检测标准，探索人骨肉瘤组织和癌旁组织之间差异miRNA表达情况。结果:在miRNA2.0芯片人物种的miRNA表达谱1205个（前体1105个）已知miRNAs中，两例人骨肉瘤组织和癌旁组织相比较的差异表达情况如下:标本Ca-1上调272个miRNAs，下调96个miRNAs;标本Ca-2上调406个miRNAs，下调218个miRNAs;两者共同上调108个miRNAs;共同下调40个miRNAs。结论:miRNAs在骨肉瘤发生发展及转移中起到重要的调节作用。 第二部分:microRNA-143在骨肉瘤发生发展和转移中的作用及其相关机制研究 目的:研究miRNA芯片结果中显著低表达的miR-143在骨肉瘤发生发展及转移中的作用及相关机制。方法:以两个骨肉瘤细胞株U-2OS、MG-63、成骨细胞株hFOB1.191以及骨肉瘤临床样本为研究对象，采用细胞培养、RNA抽提、qRT-PCR、Western blot分析、转染、体外细胞活性实验、凋亡实验、裸鼠体内成瘤实验、3'UTR荧光素酶报告检测等实验方法，并统计相应的病例加以分析miR-143在骨肉瘤细胞增殖、凋亡及致瘤性中的作用。实验中采用Student t检验比较不同组之间的差异， P＜0.01时具有显著性差异。结果:1、miR-143在骨肉瘤细胞株U-2OS、MG-63和骨肉瘤标本中呈低表达，验证了miRNA芯片结果。2、miR-143可以降低骨肉瘤细胞活性，促进肿瘤细胞凋亡，抑制骨肉瘤致瘤性。3、miR-143可以靶向抑制抗凋亡分子Bcl-2。4、miR-143在骨肉瘤细胞株中的促进凋亡的作用主要是通过抑制Bcl-2的表达来实现。结论:miR-143在主要通过抑制抗凋亡分子Bcl-2的表达，起到降低骨肉瘤细胞活性、促进肿瘤细胞凋亡、抑制骨肉瘤致瘤性的作用。 第三部分:microRNA-148a在骨肉瘤发生发展和转移中的作用及其相关机制研究 目的:研究miRNA芯片结果中显著高表达的miR-148a在骨肉瘤发生发展及转移中的作用及相关机制。方法:以两个骨肉瘤细胞株U-2OS、MG-63、成骨细胞株hFOB1.191以及92例骨肉瘤临床样本为研究对象，采用细胞培养、RNA抽提、qRT-PCR、Westernblot分析、转染、体外细胞活性实验、凋亡实验、裸鼠体内成瘤实验、3'UTR荧光素酶报告检测等实验方法，分析miR-148a在骨肉瘤细胞增殖、凋亡及致瘤性中的作用。实验中采用Student t检验比较不同组之间的差异， P＜0.01时具有显著性差异。结果:1、miR-148a在骨肉瘤细胞株U-2OS、MG-63和骨肉瘤标本中呈高表达，验证了miRNA芯片结果。2、miR-148a显著高表达和骨肉瘤发展和预后密切相关。3、在体内外实验中miR-148a均促进骨肉瘤细胞株生长。4、miR-148a主要通过靶向抑制PTEN的表达，继而激活PI3K信号通路。结论:miR-148a主要通过靶向抑制PTEN的表达，从而激活PI3K信号通路，在骨肉瘤中起到促进细胞生长，对骨肉瘤发展和预后判断起到重要的作用。

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摘要

缩略词表

前言

第一部分：利用miRNA芯片技术筛选骨肉瘤临床样本中差异表达的microRNA

引言

一、材料与方法

二、实验中所用主要的试剂和仪器

三、实验方法及步骤

四、芯片实验结果

五、芯片数据分析

六、讨论

第二部分：miR-143在骨肉瘤发生发展和转移中的作用及其相关机制研究

引言

一、材料与方法

二、主要实验方法及步骤

三、主要实验结果

四、讨论

第三部分：miR-148a在骨肉瘤发生发展和转移中的作用及其相关机制研究

引言

一、材料与方法

二、主要实验方法及步骤

三、主要实验结果

四、讨论

全文总结

参考文献

致谢

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