NS-PSIS用于大鼠深II度烧（烫）伤感染创面治疗效果的实验研究

摘要

研究目的： 建立规范、可重复的烧（烫）伤创面感染动物模型；并观察使用自主研制的纳米-银猪小肠粘膜下层基质（NS-PSIS）作为烧（烫）伤敷料治疗烧（烫）伤感染创面后的愈合效果。 研究方法： 1．动物烧（烫）伤感染模型的建立及筛选：采用自制恒温烫伤工具，实验动物采用SD大鼠；根据烫伤结果筛选出最佳的致伤温度、致伤时间以及烧（烫）伤感染模型的细菌接种浓度，建立并筛选出规范的、可重复的深Ⅱ度烧（烫）伤感染创面的动物模型。 （1）大鼠烧（烫）伤创面模型的制备：随机选取36只SD雄性大鼠，随机分为四组，麻醉后大鼠颈背部近两耳之间皮肤脱毛、备皮，使用自制恒温烫伤工具分别在每只大鼠备皮区建立一个烫伤创面。各组致伤时间分别为5s、10s、15s、20s。致伤24小时后观察创面大体变化，取创面组织及创面周围组织行病理组织学观察。根据创面病理组织学观察结果及完全创面愈合筛选制备深Ⅱ度的烧（烫）伤创面最佳致伤作用时间。 （2）大鼠烧（烫）伤创面感染模型的制备：随机选取120只SD大鼠，随机分为四组，每组30只。按照前述方法与筛选的最佳致伤时间，建立深Ⅱ度烫伤创面。伤后即刻在实验组大鼠创面分别接种1ml含1.5×109、1.5×107、1.5×105cfu/ml预先调配的铜绿假单胞菌标准菌株（ATCC27853）的菌液（每种浓度接种30只大鼠），对照组创面接种等量的生理盐水作为对照。同等洁净环境下饲养，接种细菌后3天、5天、7天、10天、14天时在相对无菌条件下取创面组织检测计算创面组织相对细菌含量，7天、14天时处死大鼠，取部分创面组织及肺脏、肝脏、肾脏组织，常规固定、包埋处理后行HE染色在显微镜下观察创面的组织学改变及各脏器炎症反应变化情况；大鼠处死前心脏采血，离心后留取各组血清样本，使用ELISA方法检测各组大鼠血清中炎症反应相关因子IL-6、IL-10，CRP含量；再分别记录4组大鼠体重变化及创面大小，进行统计学分析以筛选建立深Ⅱ度烫伤感染模型的最佳接种细菌悬液浓度。 2．制备纳米-银抗感染生物衍生材料并行体外抑菌实验：使用新鲜猪空肠制备猪小肠脱细胞粘膜下层基质（PSIS）；根据前期实验结果配制浓度为50ug/ml纳米-银溶液，将消毒灭菌后的猪小肠粘膜下层基质材料浸润于的纳米-银溶液中，体积比为100-120：1，在生物反应器中以50rpm/min的速率37℃震荡24小时以制备成纳米-银猪小肠粘膜下层基质（NS-PSIS）。将PSIS和NS-PSIS消毒后制成直径为1cm大小的圆形材料，相同大小的优拓（Urgotul）纱布作为对照，平放入预先接种铜绿假单胞菌标准菌株的培养皿中，在细菌培养箱中37℃，5%CO2条件下共培养24h后，观察两者的抑菌效果。 3.自制的纳米-银抗感染生物衍生材料用于烧（烫）伤感染创面的治疗：随机选取健康雄性SD大鼠48只，随机分成四组，每组12只，根据上述建立深Ⅱ度烫伤感染创面最佳暴露时间与接种细菌悬液浓度建立深Ⅱ度烫伤感染创面，实验组分别用与创面面积等大的NS-PSIS，PSIS和优拓（Urgotul）覆盖创面，阴性对照组在烫伤感染创面建立后不做任何处理。术后动物分笼饲养，保持饲养环境相对干燥卫生。敷料隔日更换一次，每日创面添加无菌生理盐水，保持敷料湿润。在创面治疗后当日、3天、5天、7天、10天、14天观察NS-PSIS、PSIS、优拓（Urgotul）治疗后及阴性对照组背部创面大小变化及大鼠体重变化。术后7天，14天麻醉处死大鼠前心脏取血，取部分肺脏，肝脏，肾脏，14天时取烫伤创面组织。采用ELISA试剂盒定量检测各组大鼠血清中炎症反应相关因子IL-6、IL-10，CRP含量；脏器及创面组织常规固定、包埋处理后HE染色观察各组创面的愈合情况及各主要脏器炎症反应变化情况，所有的组织切片均在光学显微镜下观察记录。 研究结果： 1．致伤后创面完整愈合时间：烫伤5s组11.33±1.21d；烫伤10s组13.33±1.03d；烫伤15s组20.50±1.76d。烫伤20s组22±2.1d。烫伤15s及20s愈合时间基本符合深Ⅱ度愈合时间标准，两组愈合时间无明显差异（15s vs20s，t=1.640，p＞0.05，95%CI：-4.177to1.177）。结合致伤后24h创面病理学检查确立15s为深Ⅱ度烫伤创面致伤的最佳时间。 2．1.5×109cfu/ml接种组大鼠创面及系统性炎症反应均较为明显，7天时大鼠血清中炎症反应相关因子IL-6、IL-10、CRP的含量在1.5×109cfu/ml接种组均较单纯烫伤组有明显升高（IL-6：t=5.883，P＜0.05；IL-10：t=6.710，P＜0.05；CRP：t=5.772，P＜0.05）且CRP在1.5×109cfu/ml接种组中浓度值均高于1.5×107cfu/ml接种组和1.5×105cfu/ml接种组，有明显统计学差异（t=3.457，P＜0.05；t=5.951，P＜0.05）；14天时大鼠血清中炎症相关因子IL-6、IL-10、CRP浓度在1.5×109cfu/ml接种组均较单纯烫伤组有明显升高（IL-6：t=22.47，P＜0.05；IL-10：t=5.811，P＜0.05；CRP：t=3.483，P＜0.05）且IL-6在1.5×109cfu/ml接种组中浓度值均高于1.5×107cfu/ml接种组和1.5×105cfu/ml接种组，有明显统计学差异（t=6.945，P＜0.05；t=7.476，P＜0.05）。创面组织细菌计数7day和14day时均大于1.0×105cfu/g，且明显延长大鼠创面的愈合、影响大鼠正常生长代谢。 3.选择制备NS-PSIS的纳米-银溶液的最佳抑菌浓度为50ug/ml，通过体外抑菌实验可见NS-PSIS的抑菌效果明显优于PSIS和Urgotul纱布。 4．三种敷料用于烫伤感染创面后3天、5天、7天、10天、14天分别记录创面大小及大鼠体重，分别对7天和14天的创面大小及体重变化进行统计学分析：NS-PSIS组明显促进创面愈合及恢复大鼠的正常生长代谢。7天时大鼠血清IL-6、IL-10、CRP在NS-PSIS组明显下降，均较阴性对照组有明显差异（IL-6：t=3.258，P＜0.05；IL-10：t=3.001，P＜0.05；CRP：t=3.474，P＜0.05）；IL-6、IL-10在NS-PSIS组较PSIS组下降较为明显（IL-6：t=3.267，P＜0.05；IL-10：t=10.15，P＜0.05）；14天时NS-PSIS组血清中的IL-6、IL-10、CRP浓度均较阴性对照组有明显下降（IL-6：t=5.701，P＜0.05；IL-10：t=6.739，P＜0.05；CRP：t=3.474，P＜0.05）；同时NS-PSIS组血清中的IL-6、IL-10、CRP浓度较PSIS组下降更为明显（IL-6：t=4.454，P＜0.05；IL-10：t=6.967，P＜0.05；CRP：t=4.168，P＜0.05）；NS-PSIS组与Urgotul组血清炎症反应相关因子仅14天时IL-10有明显差异（t=3.088，P＜0.05）。病理组织学检查发现NS-PSIS组创面可见炎性细胞浸润明显减轻，上皮组织再生明显，真皮层胶原纤维及成纤维细胞增生，排列紧密有序。各主要脏器炎性细胞浸润及炎症性病理变化较阴性对照组明显改善。 研究结论： 1.使用自制恒温烫伤仪，烫头面积6cm2、烫头温度110±10℃，致伤压力为恒温烫伤仪自重（约0.5kg），烫伤时间为15s，致伤部位选取大鼠颈背近耳后部位；创面接种1.5×109cfu/ml铜绿假单胞菌标准菌株（ATCC27853）可建立规范、可重复性较高的深Ⅱ度烫伤感染模型，可以用于烧（烫）伤感染创面的药物及敷料的研究。 2.自主研制的抗感染生物衍生材料猪小肠粘膜下层基质（NS-PSIS）体外抑菌效果、降低烫伤感染创面局部炎症反应及促进创面愈合方面优于Urgotul，NS-PSIS在改善系统性炎症发应方面有较好的效果，但尚无法完全证明其在降低系统性炎症反应较Urgotul有更为良好的效果。但通过进一步的改进制作方法和性能，NS-PSIS可以成为一种新型敷料用于烧（烫）伤创面感染的治疗。

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