靶向uAR的胰腺癌双模态分子探针构建及体内MR/光学成像研究

摘要

第一部分:胰腺癌靶向uPAR的双模态分子探针的构建
　　研究背景:根治性手术切除对于早期胰腺癌患者而言，是非常重要的预后因素。如果能在术中确定原发肿瘤的浸润边界及局部侵犯的范围，将会显著降低肿瘤的复发及转移，提高病人的生存期。基于上转换纳米颗粒(upconversion nanoparticles，UCNP)的分子影像探针为胰腺癌边界的检测带了巨大希望。这些上转换纳米材料与传统的染料非常不同，它们能够吸收和结合多个低能光子，通过反斯托克过程释放单一的高能光子即近红外(near-infrared，NIR)发射光，有效地提高了光穿透组织的能力。并且，由于生物体内没有荧光体具有相似的性质，自身荧光干扰可以在其成像中完全避免，从而增强了图像的信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)。此外，上述纳米颗粒基质中含有顺磁性稀土元素钆(Gd)，颗粒本身具有本征的磁共振和上转换特性，为双模态分子探针的构建提供了理想载体。酶的活性是肿瘤侵袭的关键因素，以酶直接作为成像靶点将有助于我们明确肿瘤浸润的边界。尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinaseplasmin-ogen activator receptor, uPAR)属于丝氨酸蛋白酶，它与其配体尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen，uPA)结合后，调节多条信号通路，这些信号通路关系到细胞外基质的降解，细胞的迁移，肿瘤的转移扩散以及肿瘤血管生成等方面，促进了肿瘤的浸润。这种在胰腺癌边界及肿瘤间质细胞中高度表达的膜外受体，为肿瘤边界成像提供了非常有价值的靶点。重组的氨基末端片段(amino termino fragment，ATF)是uPA与受体结合的结构域，它可以作为靶向探针与上转换纳米颗粒载体连接，构建主动靶向探针UCNP-ATF。该探针改变了传统荧光造影剂单一的、下转换发光的成像模式，增强了图像的信噪比及光穿透深度，整合了目前先进的纳米技术、分子靶向和多模态成像，有望实现对胰腺癌边界的判定。
　　目的:制备以顺磁性稀土纳米颗粒为基质的高发光强度上转换纳米颗粒，并对其表面生物相容性及功能化修饰;探讨制备方法和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰等因素对uPAR靶向的磁共振/上转换发光纳米颗粒的晶体表征、光学性质及弛豫时间的影响;合成重组的多肽ATF;研究UCNP-ATF的磁共振/上转换发光纳米颗粒在体外对人胰腺癌细胞(SW1990)的靶向结合能力。
　　方法:通过高温法合成了NaGdF4∶Yb，Er纳米颗粒。为进一步增强发光强度，通过种子生长法，用NaGdF4∶Yb，Er制备了具有壳核结构的新型纳米颗粒NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4.通过透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)扫描，检测NaGdF4∶Yb，Er及NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4纳米颗粒的粒径、形态等本征特性，并采用光谱扫描进行光学性质的研究。通过配体交换法将PEG的磷酸盐和马来酰亚胺基团置换到核壳纳米颗粒上，使其具有水溶性及生物相容性，并利用发光光谱，表征修饰前后上转换发光的稳定性。同时，我们采用了临床使用的3.0 T MRI(SiemensMAGNETOM Skyra)，对修饰后的纳米颗粒的弛豫率进行了表征。通过PCR扩增的方法，获取uPAR1-135的氨基末端片段的cDNA。重组多肽ATF的特异性扩增片段经载体pET30α的转化，在大肠杆菌DH5α株中表达，并用Ni2+-NTA柱进行纯化。将提纯产物分别用Bradford法以及SDS-PAGE、Western-Blot检测，从而确定产物的纯度和浓度。随后，通过上转换纳米颗粒表面上的马来酰亚胺残基与多肽ATF发生反应，完成UCNP-ATF探针构建。最后，通过动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)表征UCNP-ATF探针在PBS中的水合尺寸，并使用相同方法，偶联相同分子量的不相关鼠蛋白，构建非靶向性探针UCNP-mIgG作为体外细胞实验的对照。在与靶向和非靶向探针共同孵育以后，人胰腺癌细胞系SW1990经流式MarkⅡ及MRI扫描后，分别在磁共振及近共聚焦显微镜下成像，检测探针体外与细胞的结合能力。
　　结果:标准化Er3+粒子浓度以后，光谱结果显示包壳后纳米颗粒的整体发光强度是包壳前强度的70倍，表明核壳结构显著增强了纳米颗粒的发光强度。并且，TEM图像显示，包壳后纳米颗粒的尺寸、形态几乎没有发生改变，平均粒径为18.6±0.9nm。PEG修饰后的水溶性非核壳结构和核壳纳米颗粒，在PBS中的光谱结果显示，两种颗粒的发光强度明显下降，这可能是由于水分子的高能振动模式增加了激发态的非辐射弛豫所致。尽管包壳过程对PEG配体置换过程所造成的发光淬灭并没有明显改善，但是核壳纳米颗粒仍较非核壳结构的纳米颗粒高57倍。细胞体外实验MRI成像结果显示，包壳后的纳米颗粒其摩尔弛豫率r1较包壳前稍有下降，考虑与纳米粒径稍有增加相对减小了颗粒比表面积，导致表面Gd3+离子比例相对减少有关。通过Ni柱提纯的重组ATF，以BSA为标准，用Bradford方法测定其浓度为0.4mg/ml，经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE及Western-Blot分析其纯度约90％。探针UCNP-ATF构建前后的DLS结果显示，探针构建后水合尺寸明显增大，说明纳米颗粒与多肽连接成功，并且DLS上没有出现其它明显的峰位，表明在连接过程中没有形成沉淀或较大的聚集体。对人胰腺癌细胞系SW1990孵育靶向探针的ImageStream流式MarkⅡ显示图像，UCNP-ATF探针能够与细胞膜表面识别结合。MRI结果同样证实，靶向探针比起非靶向探针对细胞有明显的T1信号增强作用及特异性。
　　结论:1.制备了强上转换发光效率的小粒径(＜30nm)生物相容性纳米颗粒。2.合成了多肽ATF，并与上述生物相容性纳米颗粒连接，构建了uPAR靶向的双模态探针。3.细胞体外实验证明了该探针具备靶向人胰腺癌的主动识别能力。
　　第二部分:胰腺癌靶向uPAR的双模态分子探针体内MR/光学成像研究
　　研究背景:对于探针的成像研究，除了敏感特异的成像手段，建立能更好表现出肿瘤血管生成，肿瘤病理生理过程以及肿瘤微环境的动物模型，同样也是非常关键的。由于稀土纳米颗粒有着先进的生物相容性及多功能化修饰的特性，NaGdF4∶ Yb，Er纳米颗粒通过主动靶向的方式能够成功实现皮下小于2mm的肿瘤探测。比起皮下肿瘤模型，动物原位模型对于模拟人体肿瘤真实的微环境及较高的肿瘤转移率都有着很高的优越性。然而，由于建模过程复杂及目前纳米材料糟糕的生物学表现，在动物原位肿瘤模型中，开展的分子探针体内成像的研究并不多见。据最近的文献称，靶向uPAR的多肽荧光探针被报道用于原位胰腺癌的成像研究中，然而，肿瘤信号却受到周围组织严重的自发荧光干扰，很难分辨。因此，无论是原位肿瘤模型的建立，还是开发适合体内成像的新型光学探针，目前都面临着诸多挑战。
　　目的:通过胰腺癌原位动物模型开展双模态成像及病理学评估，探索uPAR靶向的磁共振/上转换发光肿瘤纳米探针在判定胰腺癌边界的成像应用，为下一步术中导航奠定基础。
　　方法:通过外科手术建立裸鼠原位胰腺癌种植模型。为了在体监测肿瘤生长情况，稳定转染绿色荧光蛋白(GFP)及萤火虫荧光素酶(Luciferase)基因的SW1990细胞系(GFP-Luc-SW1990)被用于监测肿瘤的发展。我们将慢病毒载体（PRRL-EF1 a-GFPluc-WPRE）转染到SW1990细胞中。通过细胞流式仪分析细胞GFPluc表达情况。之后，将40uL含有5×106个GFP-Luc-SW1990细胞的悬液注入裸鼠胰腺后，通过生物自发光活体成像仪(bioluminescence imaging，BLI)验证肿瘤模型是否构建成功。在原位模型构建成功的基础上，通过对肿瘤感兴趣区的信号测量，筛选发光强度相近的裸鼠模型作为实验组和对照组。随后，通过鼠尾静脉注射3 mg/mL（15 mg Gd/Kg体重）靶向探针UCNP-ATF，分别于注射前、注射后第2、4、6小时行MRI成像及上转换发光成像。随后，通过MRI T1 Mapping序列对肿瘤区域的T1绝对值进行两个时间点比较，测算出探针MRIT1时间缩短。同样，在注射后第2、4、6小时，实验动物模型胰腺区域行上转换成像。实验结束后，荷瘤小鼠断颈处死，胰腺组织随即石蜡切片，行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。实验模型其余正常组织，经电感耦合等离子体发射光谱仪ICP检测，观察探针组织分布情况。
　　结果:细胞流式结果显示GFP及Luciferace双报告基因转染SW1990细胞的效率高达99.99％。原位种植裸鼠肿瘤模型建立10天后，BLI成像显示建模成功率达90％。MRI成像研究显示，探针于肿瘤T1增强的峰值时间出现在注射后第4个小时，在第4个小时肿瘤区域T1信号下降达21％。上转换成像结果表明，上转换发光最大强度时间也出现在第4个小时，之后随时间持续下降。探针组织分布情况显示，大部分探针集中在正常肺脏部位，但摄取量非常低，还不及注射总量的10％，表现出很好的安全性。
　　结论:基于上转换发光纳米颗粒的UCNP-ATF探针，在体内能够实现微小胰腺癌的检测，在分子及组织水平上明确肿瘤的边界，展现出了在早期胰腺癌诊断及术中导航的临床应用转化价值。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分：靶向uPAR的胰腺癌双模态分子探针的构建

一、引言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、本章小结

参考文献

第二部分：靶向uPAR的胰腺癌双模态分子探针体内MR／光学成像研究

一、引言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、本章小结

参考文献

文献综述 肿瘤荧光成像在靶向手术中的应用

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢