利用微核细胞组学试验对量子点纳米材料遗传毒作用特征的研究

摘要

目的： 量子点(quantum dot，QD)是应用较为广泛的一大类纳米材料和产品。目前已有一些研究报道表明QDs对生物细胞可产生一定的遗传毒性。但由于未对不同类型QDs做系统研究，以及由于采用不同方法，受试细胞和遗传毒性终点各异，难以揭示其毒作用特点和可能影响其遗传毒性的主要因素。 本课题从根据元素组成、结构和荧光特性分类的四类量子点中选择若干代表物，即核型量子点、核壳型量子点、合金量子点及发射不同荧光波长量子点作为受试物，采用单一细胞在相同暴露条件下同时检测多个遗传毒性终点的小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）胞质分裂阻滞微核细胞组学试验(cytokinesis block micronucleuscytome assays，CBMN Cyt assay)作为研究方法，从遗传毒效应类型、剂量-效应和时间-效应方面研究遗传毒作用特征，通过比较不同类型量子点的遗传毒性揭示可能影响其遗传毒性的因素。 方法： 1、细胞培养和染毒：采用体外胞质分裂阻滞微核细胞组学试验，以小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y细胞）作为受试细胞，清除TK-/-、TK-/0基因型自发突变细胞。取对数生长期的细胞调整细胞密度为4×105/ml接种于24孔板中，每孔加入2.45ml细胞悬液和50ul受试物，根据台盼蓝拒染试验结果，最高剂量组为受试物半数抑制浓度（IC50）1/3-1/2；再用相应溶剂进行倍比稀释，共设5个剂量浓度。阳性对照物为丝裂霉素C（MMC，终浓度为0.1μg/ml），阴性对照物为溶媒。每组设两个复孔，重悬均匀后置于37℃，5%CO2培养箱中培养4h后，每孔加入20μl终浓度为4.5μg/ml的细胞松弛素B（cytochalasinB），继续培养至24h。 2、收集细胞、制片和阅片：离心收获细胞，加入0.075M KCl低渗，用固定液（冰醋酸∶甲醇=1∶3）进行固定、然后滴片，每孔滴片2-3张，自然晾干，再用10%Giemsa染色。在显微镜下阅片，每个剂量组计数4张片，统计8000个双核细胞中出现Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽的数目。各评价指标参照Fenech等人提出的判定标准， 结果： （一）CdSe和CdTe-COOH两种核型量子点的遗传毒性 1、硒化镉量子点（cadmium selenide quantum dot，CdSe QD）在0.313nmol/L、0.625nmol/L、1.25nmol/L、2.5nmol/L和5.0nmol/L剂量浓度下，与阴性对照相比，其均能诱导产生总微核、Ⅰ型微核、核质桥和核芽效应（p＜0.05），且存在一定剂量-效应关系趋势；在0.625nmol/L浓度时诱导产生Ⅱ型微核效应（p＜0.05），但无明显的剂量-效应关系。时间-效应结果显示：总微核、Ⅰ型微核和核芽数目在染毒36h达到峰值，存在明显的时间-效应关系；Ⅱ型微核和核质桥数目分别在染毒27h和36h达到峰值，但时间-效应关系不明显。 2、碲化镉量子点（cadmium telluride quantum dot，CdTe-COOH QD）在0.5nmol/L，1.0nmol/L，2.0nmol/L，4.0nmol/L，8.0nmol/L受试浓度下，与阴性对照相比，CdTe-COOHQD在0.5nmol/L浓度组可引起Ⅰ型微核和核芽效应增加（p＜0.05）；在1.0nmol/L浓度组进一步引起总微核和核质桥增加（p＜0.05）；在2.0nmol/L以上浓度组才诱导Ⅱ型微核（p＜0.05）。时间-效应结果显示：在染毒9h首先出现核质桥增加，但随着染毒时间的延长其数目明显减少；总微核、Ⅰ型微核和Ⅱ型微核在染毒18h增加，在染毒36h达到最高。 （二）CdSe/ZnS和CdTe/ZnSe-COOH两种核-壳型量子点遗传毒性 1、CdSe/ZnS QD在受试剂量为0.625nmol/L，1.25nmol/L，2.5nmol/L，5.0nmol/L，10.0nmol/L下，与对照组相比，0.625nmol/L组可诱导总微核、Ⅰ型微核和核芽效应（p＜0.05）；在1.25nmol/L以上剂量组可诱导其它微核组效应（p＜0.05），均存在剂量-效应趋势。时间效应结果显示，该量子点首先产生核质桥效应（染毒9h）；染毒18h后出现其它效应，在染毒36h达到峰值，但核质桥降低至对照组水平。 2、CdTe/ZnSe-COOH QD受试剂量为2.5nmol/L，5.0nmol/L，10.0nmol/L，20.0nmol/L，40.0nmol/L。与对照组相比，在5.0nmol/L可诱导总微核和Ⅰ型微核增加（p＜0.05），在20.0nmol/L以上剂量组可诱导其它微核组效应（p＜0.05），并有一定的剂量-效应关系。时间-效应结果显示：该量子点染毒9h即可产生核质桥效应（p＜0.05），但随染毒延长，数目反而降低；染毒至18h总微核和Ⅰ型微核效应增加（p＜0.05）,且数目达到峰值；36hⅡ型微核和核芽数目达到峰值（p＜0.05）。 （三）荧光波长分别为490nm和540nm的CdSeS/ZnS-COOH合金量子点的遗传毒性 1、490nmCdSeS/ZnS-COOH量子点受试浓度为0.0625mg/ml,0.125mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，0.1mg/ml。与阴性对照相比，在0.0625mg/ml以上剂量组可诱导总微核、Ⅰ型微核和核芽（p＜0.05）；在0.5mg/ml以上剂量组可诱导Ⅱ型微核（p＜0.05），这些效应均有剂量-效应趋势，但未观察到核质桥效应。时间-效应结果显示染毒18h可诱导总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核和核芽增加，在27h达到峰值。但其它效应未见增加和时间效应关系。 2、540nm CdSeS/ZnS-COOH量子点受试浓度0.0625mg/ml,0.125mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，0.1mg/ml。与阴性对照相比，在0.0625mg/ml以上剂量组可见Ⅰ型微核和核质桥增加（p＜0.05）；在0.25mg/ml以上剂量组其它各效应均增加（p＜0.05）并有有剂量-效应趋势。时间效应结果显示染毒18h可诱导总微核和Ⅰ型微核、Ⅱ型微核和核芽增加，27h达到峰值，染毒27h出现核质桥效应且数目达到峰值。 结论： 1、核型CdSe和CdTe量子点，在毒作用性质上无明显差异，均可造成Ⅰ型和Ⅱ型微核、核质桥和核芽等微核组效应。但在毒作用特征上存在一定的差别，从剂量-效应上CdSe QD在最低剂量首先诱导总微核、Ⅰ型微核、核质桥和核芽效应，随着剂量增加进一步产生Ⅱ型微核效应；CdTe-COOH QD在最低剂量首先诱导Ⅰ型微核和核芽效应增加，随着剂量增加产生其它效应。CdSe QD产生遗传毒性的剂量低于CdTe-COOH QD。两种量子点多数效应均有一定的时间-效应关系，但不同效应的峰值时间有差异。 2、核壳型CdSe/ZnS和CdTe/ZnSe-COOH量子点，均可诱导受试细胞产生总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽效应，表明其在毒作用特征上无明显差别。从剂量-效应上CdSe/ZnS QD在最低剂量首先诱导Ⅰ型微核和核芽效应，随着剂量增加产生其它效应，而CdTe/ZnSe-COOH QD在最低剂量首先诱导Ⅰ型微核增加；CdSe/ZnS QD的遗传毒性大于CdTe/ZnSe-COOHQD。从时间-效应上，两者最早出现的效应均为核质桥（9h），并随时间增加逐渐减低；其它效应多在36h达到峰值。 3、荧光波长分别为490nm和540nm的CdSeS/ZnS-COOH合金量子点，均可诱导Ⅰ型和Ⅱ型微核和核芽等微核组效应，但在毒作用性质上存在一定差异，490nm CdSeS/ZnS-COOH QD不能诱导产生核质桥效应。从剂量-效应上490nm CdSeS/ZnS-COOH QD在最低剂量首先诱导Ⅰ型微核和核芽效应，而540nm CdSeS/ZnS-COOHQD首先诱导Ⅰ型微核效应。从时间-效应上，两者均有随时间增加而增加的趋势，在27h达到峰值后下降。 4、荧光发射波长为400nm、420nm、460nmCdS三种核型量子点：在遗传毒作用性质上相同，均可诱导微核组效应，且有明显的剂量-效应趋势；但在遗传毒作用特征上有一定差异。从剂量-效应上400nmCdS QD在最低剂量首先诱导Ⅰ型和Ⅱ型微核，而420nm、460nmCdS QD首先诱导核质桥和核芽效应。从时间-效应上，400nm的CdSQD在9h可诱导Ⅰ型、Ⅱ型微核增加；420nm的CdSQD在9h可诱导Ⅰ型和核质桥数增加；460nm的CdSQD在18h才诱导Ⅰ型和核质桥数增加；Ⅰ型、Ⅱ型微核和总微核在27h达到高峰；核质桥数在18h达到高峰此后开始下降，400nm和420nmCdSQD核芽数在27h达到高峰，而460nmCdSQD在36h达到高峰。 上述研究结果表明：量子点纳米材料的遗传毒作用特征与其结构、核心组成、暴露浓度、暴露时间、表面涂层和荧光发射波长有关；由于不同效应的生成机制不同，不同量子点纳米材料的产生遗传毒性的作用机制也有差异。

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