尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁预防人工关节假体周围骨溶解的基础研究

摘要

本研究旨在探讨UTI对RANKL诱导破骨细胞活化是否具有抑制作用及与MMP-2,MMP-9的关系，进一步探讨UTI对PMMA诱导破骨细胞分化、增殖、活化的抑制作用及分子机制。同时，探讨UTI对PMMA颗粒诱导MC3T3-E1鼠前体OB凋亡的干预作用，并通过建立动物骨溶解模型，在体内研究中证实UTI可能具有的抑制骨吸收的作用，揭示其在预防假体周围骨溶解和无菌性松动中的潜在价值，以期能为药物防治假体周围骨溶解提供新的思路。 第一部分 乌司他丁对RANKL诱导RAW264.7细胞分化、增殖、活化的抑制作用及与MMP-2,MMP-9的关系 目的：探讨乌司他丁(UTI)在RANKL诱导RAW264.7细胞分化、增殖、活化的抑制作用及与MMP-2，MMP-9的关系。 方法：体外培养小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7；实验分为4组：空白组、RANKL诱导组、RANKL+UTI1组和RANKL+UTI2组。 结果：在倒置相差显微镜下观察培养12h、24h后RAW264.7细胞的生长状态良好；噻唑蓝法结果表明，分别加入500、1500、5000U／mL UTI后24h、48h、72h的吸光度值（A值）与空白组比较，差异均无统计学意义；而加入15000、50000U／mL的UTI后48和72h的吸光度值与空白组相比均显著性降低。 结论：UTI对RANKL诱导破骨细胞活化具有一定的抑制作用，且可降低MMP-9的表达水平及活性，提示其在预防假体周围骨溶解中可能具有潜在价值。 第二部分 乌司他丁对RANKL/PMMA诱导RAW264.7细胞分化、增殖、活化的抑制作用及分子机制 目的：探讨乌司他丁对RANKL/PMMA诱导破骨细胞分化、增殖、活化的抑制作用及其分子机制。 方法：体外培养小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7,实验分为5组：空白组、RANKL诱导组、PMMA诱导组、PMMA+UTI1组和PMMA+UTI2组。 结果：MTT法检测结果显示：共培养12h时，与空白组相比，各组RAW264.7细胞增殖无明显变化；共培养24h、48h和72h时，RANKL诱导组、PMMA诱导组中RAW264.7细胞增殖较空白组显著增高,PMMA+UTI2组细胞增殖无明显变化；而PMMA+UTI1组与空白组相比，在共培养24h、48h时RAW264.7细胞增殖显著增高，培养72h时细胞增殖则无明显变化。 结论：UTI作为一种广谱蛋白酶抑制剂，可能通过MARK和NF-κB两条信号途径，来抑制破骨前体细胞的分化、增殖和成熟，且可抑制成熟破骨细胞的活性及骨吸收作用，故其在预防假体周围骨溶解和无菌性松动中可能具有一定的潜在价值。 第三部分 乌司他丁对骨水泥颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡的干预作用 目的：探讨乌司他丁（UTI）对骨水泥颗粒（PMMA）诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞（OB）凋亡的干预作用及对IL-6、IL-10、MMP-2、VEGF、MCP-1、CollagenⅠ和OCN mRNA表达水平的影响。 方法：将第六、七代生长状态良好的MC3T3-E1细胞在体外进行培养;实验分为4组：空白组、PMMA诱导组、PMMA+UTI1组（500U/mL）和PMMA+UTI2组（5000U/mL）。 结果：细胞生长曲线分析结果：MC3T3-E1成骨细胞培养至第1～4d，呈对数生长期增殖生长,培养至第4～7d增殖生长相对缓慢,达到增殖生长的高峰值,培养至第7～lOd，MC3T3-E1成骨细胞增殖生长逐渐呈下降趋势。在倒置相差显微镜下（×400）观察MC3T3-E1细胞第1～4d增殖生长情况，随着时间延长，MC3T3-E1细胞数量呈对数期生长，且细胞形态趋于成熟。噻唑蓝(MTI)法结果表明，0.1mg/ml的PMMA共培养24h、48h和72h后，均对MC3T3-E1细胞增殖活性有显著抑制作用,在加入不同浓度UTI（500、5000U／mL）24h、48h和72h后，MC3T3-E1细胞增殖活性逐渐增强，呈剂量时间依赖关系。碱性磷酸酶（ALP）染色检测结果显示，各组培养24h～72h后，在显微镜下均可见胞质内浅棕色至棕黑色颗粒，数量及深浅不一。PMMA组的染色强度及染色分布面积明显低于空白对照组（P＜0.05）；而与PMMA组相比，PMMA+UTI1组（500U/mL）和PMMA+UTI2组（5000U/mL）的染色强度及染色分布面积均显著增加（P＜0.05),呈时间依赖关系。茜素红染色检测结果显示，在倒置显微镜下观察（×400）见空白对照组有较大的矿化结节,且染色较深,呈红褐色；PMMA组未见明显的矿化结节;而PMMA+UTI1和PMMA+UTI2组有矿化结节形成,但与空白对照组比较,染色较浅,且矿化结节较小,较稀疏。流式细胞仪检测结果显示，与空白对照组相比，PMMA诱导组于共培养10d、20d后细胞凋亡率均显著升高（P＜0.01）；加入UTI（5000U/mL）共培养10d、20d后，PMMA+UTI2组细胞凋亡率较PMMA诱导组均显著降低（P＜0.05）。半定量RT-PCR检测结果显示，与空白对照组相比，共培养9d后PMMA组细胞中IL-10、ColⅠ、OCN的mRNA表达均显著降低（P＜0.01），而IL-6、MMP-2、VEGF、MCP-1的mRNA表达显著升高（P＜0.01）；与PMMA组相比，PMMA+UTI2组（5000U/mL）中IL-6、MMP-2、VEGF、MCP-1的mRNA表达显著降低，而IL-10、ColⅠ、OCN的mRNA表达均显著增加（P＜0.01）。 结论：UTI对PMMA诱导MC3T3-E1鼠前OB凋亡具有一定的干预作用，可促进成骨细胞中IL-10、ColⅠ和OCN的生成，并降低IL-6、MMP-2、VEGF和MCP-1mRNA的表达水平，提示其在预防假体周围骨溶解中可能具有潜在价值。 第四部分 乌司他丁在骨水泥磨屑诱导鼠Air Pouch骨溶解模型中的抑制炎性骨溶解作用 目的：通过建立骨水泥磨屑（PMMA）诱导鼠Air Porch骨溶解模型，体内研究乌司他丁（UTI）对MMP-9,TNF-a，IL-6,IL-10,RANK和RANKL蛋白表达的影响及抑制破骨细胞骨吸收作用，进一步证实UTI可能具有的抑制假体周围炎性骨溶解作用。 方法：采用BALB/c鼠（6-8周龄雄性）建立实验鼠骨溶解气囊模型。实验分为4组：空白对照组、PMMA诱导组（浓度为2×108颗粒/25ul）、PMMA+UTI1组（500U/mL）和PMMA+UTI2组（5000U/mL）。 结果：HE染色切片分析结果显示，在对照组中置入的颅骨骨片骨形态保持完整。然而，在经PMMA颗粒刺激后的气囊中可观察到置入颅骨骨片的骨侵蚀现象，尤其在与气囊交界处可观察到置入骨片有明显的骨吸收陷窝，囊膜厚度和炎性细胞浸润明显增加。经注射UTI后，炎症反应明显缓解，置入骨片的骨吸收陷窝数明显减少。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测结果显示，在实验区域植入PMMA颗粒后,可诱发破骨细胞的生成,PMMA诱导组成熟破骨细胞数量(173.592±16.365个／cm2)与空白对照组（43.294±5.412个／cm2）比较,差异有统计学意义（P＜0.05）；给予UTI处理后，破骨细胞的生成明显受到抑制，与PMMA诱导组相比，PMMA+UTI1组（106.319±23.041个／cm2）和PMMA+UTI2组（75.254±6.817个／cm2）中实验区域破骨细胞数均显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。TRAP活性分析检测结果显示，与PMMA组比较，PMMA+UTI1组（500U/mL）和PMMA+UTI2组（5000U/mL）中成熟破骨细胞的功能与活性均显著降低（P＜0.05），呈剂量依赖关系；破骨细胞骨吸收陷窝面积分析结果显示，与PMMA组比较，PMMA+UTI1组（500U/mL）和PMMA+UTI2组（5000U/mL）中破骨细胞骨吸收陷窝面积均显著降低（P＜0.05），呈剂量依赖关系。免疫组化检测结果显示，与空白对照组相比，PMMA诱导组中MMP-9,TNF-a，IL-6,RANK和RANKL蛋白表达显著增加（P＜0.05），而IL-10染色阳性细胞百分率则显著降低(P＜0.05)；与PMMA诱导组比较，PMMA+UTI1(500U/mL)组中MMP-9,TNF-a，IL-6,RANK和RANKL的染色阳性细胞百分率均显著降低，而IL-10的染色阳性细胞百分率无明显变化（P＞0.05）；PMMA+UTI2(5000U/mL)组中MMP-9,TNF-a，IL-6,RANK和RANKL的染色阳性细胞百分率均显著降低，而IL-10染色阳性细胞百分率则显著升高。ELISA检测结果显示，与空白对照组相比，PMMA诱导组中MMP-9,TNF-a，IL-6,RANK和RANKL蛋白分泌水平显著增加，而IL-10染色阳性细胞百分率则显著降低；与PMMA诱导组比较，PMMA+UTI1(500U/mL)组中IL-6,IL-10蛋白分泌水平无明显变化；PMMA+UTI2组中MMP-9,TNF-a，IL-6,RANK和RANKL的蛋白分泌水平均显著降低，而IL-10蛋白分泌水平则显著升高。 结论：在鼠骨溶解模型中，应用乌司他丁后可降低炎症骨溶解反应。其在预防假体周围骨溶解和无菌性松动中可能具有一定的潜在价值。

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